[发明专利]一种猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂及其制备方法

说明书

 

技术领域：

    本发明提供一种猪血有限酶解提取后分离得到的猪血抑菌剂，同时还提供了该抑菌剂的制备工艺，属于生物化学技术领域。

背景技术：

我国每年屠宰生猪近6亿头，占世界生猪屠宰量得45%，猪血资源十分丰富，但目前除少量用于制作食用食品外，基本未得到开发利用，不仅浪费资源，而且污染环境。新鲜猪血中含有丰富的蛋白资源，从猪血中提取的抑菌剂具有良好的生物抑菌活性，能杀灭如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等多种病原菌。同时，目前采用酶法生产生物蛋白制剂是当前的研究热点，因其安全性极高、价廉、易于推广而引起人们的极大兴趣。从猪血中所提取的抑菌制剂性质稳定，是不可多得的稳定的生物抑菌制剂，可广泛的应用于生物制药领域中。

传统的从猪血中通过酶解法获取抑菌剂方法，首先需要向猪血中添加抗凝剂，如：肝素、柠檬酸钠，随着科学技术的发展和人们对自身安全的重视度的增加，外源添加物的使用目前已经成为天然产品加工和生产领域中越来越需要谨慎对待的事件。

另外，从猪血中通过酶解法获取抑菌剂，在酶解前需要通过加酸、加碱或者加热的办法诱使血中蛋白质变性，变性的蛋白质结构松散舒展可以被蛋白酶切割成更多的、分子量更小的肽片段。但是，这种变性使得蛋白质的结构展开不具有重复性，这大大的降低了酶解产物的质量稳定性，提高了质量控制的难度；在酶解法获取抑菌剂工艺中，主要是采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶等最适温度范围较宽、酶切位点较多的蛋白水解酶，目的是获得分子量尽可能小的肽组分，缺点是上述酶的酶切位点较为广泛重现性差，酶解制备活性肽的工艺难于稳定和具体掌握。同时，采用控制酶解时间来结束酶解反应，往往不另外终止酶解反应，酶的自切割产物往往混杂在产品中，从而影响酶解产品的品质。而在从酶解液中分离抑菌剂的主要方法是离子交换层析、分子筛层析和膜分离，仅从样品处理速度和量来说，膜分离>离子交换层析>分子筛层析。离子交换层析和分子筛层析两种技术分别是按照酶解液中各肽类组分的表面电荷性质和分子量大小性质对样品进行分类和初步分离，其优点在于该类技术在理论和实际应用中都非常成熟，缺点样品处理量小，柱子复生慢，难于进行扩大化生产和应用；膜分离技术是按照样品的分子大小进行分离，其优点在于快速、样品处理量大、几乎不需要膜的复生与额外处理，易于进行扩大化生产和应用。

对于酶解法获取抑菌剂工艺，从酶解液中清除卟啉（血红素）及卟啉水解物的过程，主要是活性碳或者大孔树脂吸附，氯仿等有机溶剂萃取；活性碳、大孔树脂的使用在吸附卟啉及其水解物同时也吸附水解液中的活性肽成分，造成不必要的损失，氯仿等有机溶剂的使用，提高工艺的难度、成本与质控标准，也同样会降低活性组分的含量。

所述的从酶解液中分离抑菌剂的方法主要是采用低温冷冻干燥法或者高温喷雾干燥法获得抑菌剂的干粉，使得肽类组分在干燥状态下保证其生物活性，或者现用现制备，以保证抑菌剂的生物活性。

发明内容:

本发明的目的在于提供一种猪血抑菌剂，具有抑菌活性。

本发明的目的还在于提供一种猪血抑菌剂的制备方法，具有高稳定性、重现性、操作简便性、可以快速分离活性组分，清除产品中的卟啉及其水解物，便于规模放大的，适用于工业化生产的制备方法。

本发明公开的猪血有限酶解提取后分离的猪血抑菌剂，其特征在于：

是经有限酶解后再通过超滤及纳滤手段得到的分子量为500~3000的小肽混合物，F值为14.5，等电点pI值为4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很强的抑菌活性；

上述小肽混合物经nanoAcquity-UPLC BEH130 C₁₈色谱柱分离，AB Sciex 5800 MALDI TOF/TOF质谱分析，该混合物中氨基酸序列如：SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3组分含量占猪血抑菌剂总蛋白含量的86%以上，其中SEQ NO.1：SEQ NO.2：SEQ NO.3的比例为1：1：1。