[发明专利]一种干扰素突变体及聚乙二醇衍生物

说明书

技术领域

本发明涉及IFN-λ1突变体、其聚乙二醇衍生物及其制备方法，以及包含所述IFN-λ1突变体或该突变体的聚乙二醇衍生物在预防或治疗病毒性疾病、肿瘤方面的应用。

背景技术

干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。

迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为三个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前，干扰素γ和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。III型干扰素是最近发现的一类细胞因子家族，包括干扰素λ1、λ2和λ3，也称为IL-28A、IL-28B和IL-29

IL-28A、IL-28B和IL-29包含最近发现的新蛋白家族，所述蛋白质家族与I型干扰素有序列同源性，并与IL-10有基因序列的同源性。该新家族在共同所有的PCT申请WO02/086087和Sheppard等，NatureImmunol.4:63-68,2003(全文都纳入本文参考)中有详细的描述。从功能上说，IL-28和IL-29类似于I型干扰素，均能诱导细胞中的抗病毒状态，与I型干扰素不同的是，它们不显示出抗某些B细胞系的抗增殖活性。

野生型IL-29(干扰素λ1)基因编码200个氨基酸多肽，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在SEQIDNO:1中，编码本文所述的IL-29多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQIDNO:2中。IL-29的螺旋预测如下：螺旋A有氨基酸残基30(Ser)至44(Leu)所定义；螺旋B由氨基酸残基57(Asn)至65(Val)所定义；螺旋C有氨基酸残基70(Val)至85(Ala)所定义；螺旋D由氨基酸残基92(Lys)至111(Gln)所定义；螺旋E由氨基酸残基118(Thr)至139(Lys)所定义；而螺旋F由氨基酸残基144(Gly)至170(Leu)所定义。

已知IL-29分子具有5个半胱氨酸残基(PCT申请WO02/086087WO02/02627)，基于多重比对进行的IL-29的进一步分析预测，氨基酸残基第49和145位，及第112和171位的半胱氨酸将形成分子内二硫键，第15位的半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键。

无论是I型干扰素、II型干扰素还是III型干扰素，作为蛋白质药物，由于稳定性差、血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体等，在临床治疗中很大的限制。基因工程技术使大规模合成人重组蛋白成为可能，工程蛋白通过改变野生蛋白序列中的某个或某几个氨基酸，以获得相对更为稳定、比活性更高的重组蛋白，并降低其免疫原性，这在一定程度上解决了异源蛋白引起的不稳定或免疫原性问题。

尽管这样，还无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点，这些缺点造成的结果是：需频繁注射干扰素才能达到有效血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值和谷值。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。因此，人们试图采用各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效。

蛋白药物的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍在临床治疗上的应用聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇分子(PEG)键合到蛋白质分子表面上，从而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解能力提高，免疫原性和毒性降低消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等等。

发明概述

IFN-λ1上有多处氨基酸可供进行突变，但这些氨基酸序列的改变应当考虑IFN-λ1的折叠及空间结构不受影响、并至少得到可以保持相当于野生型IFN-λ1活性的突变体。本发明的目的是提供一种在第123位氨基酸进行突变得到的一种新型的突变体IFN-λ1，将第123位的Pro突变为Ser，该突变体相对于野生型IFN-λ1，活性更强、稳定性更好。

本发明提供制备可溶性IFN-λ1突变体的方法，该方法通过先构建设计IFN-λ1突变体引物，构建获得突变体基因，将所得基因插入到表达载体，将所得的载体转入到宿主大肠杆菌中，得到相应的表达工程菌，再进行发酵和诱导表达、包涵体变性和复性，得到可溶性IFN-λ1突变体。