[发明专利]一种抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒

说明书

技术领域

本发明涉及重组慢病毒，具体涉及一种能抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒。

背景技术

(1)登革病毒

登革病毒(dengue virus,DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征的病原体.登革病毒归于黄病毒科(flaviviridae)中的黄病毒属.根据包膜蛋白的抗原特异性差异，登革病毒分为4个血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型登革病毒.

病毒结构与基因组

成熟的登革病毒颗粒呈球形，直径45～55纳米，由包膜、衣壳和核酸组成.核衣壳含单股正链RNA(核糖核酸)，大小约为1.1万对碱基，含有1个开放阅读框,编码3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白。

prM蛋白是一种糖蛋白，为M蛋白的前体，在病毒成熟过程中prM糖蛋白经特异性酶酶切后形成M蛋白，它能导致病毒感染增强，并形成毒粒的表面结构.包膜蛋白E存在有诱导中和抗体和血凝抑制抗体，并且可能会引起抗体依赖的感染增强作用.非结构蛋白中NS1和NS3在病毒免疫反应中起重要作用，可诱导产生针对同型登革病毒的保护作用的抗体.

疫苗研究

登革热疫苗主要可分为传统的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗以及以质粒、腺病毒、慢病毒为载体的基因疫苗等.理想的登革疫苗应该是四价疫苗，对四种血清型登革病毒感染均有保护作用.长期以来，困扰登革疫苗发展的一个主要因素就是缺乏合适的动物模型.虽然登革病毒能够感染小鼠、猴子等动物，但这些动物感染后不出现或仅出现轻微发热等症状，而不出现登革出血热和登革休克综合征等典型症状.登革疫苗开发面临的另一个主要的问题是抗体依赖的感染增强作用.通常初次感染后，可对同型登革病毒的再次感染产生终生免疫，但对异型登革病毒的感染不但没有保护作用，往往会通过抗体依赖的感染增强作用机制促进病毒的感染.登革疫苗的研究已有50多年的历史，但至今仍无安全有效的疫苗用于临床.虽然传统的灭活疫苗、减活疫苗已取得一定的进展，但其安全性、有效性及稳定性等问题仍有待进一步的研究.以RNA干扰为基础的基因疫苗作为一种新型疫苗，具有传统灭活/减毒活疫苗无法比拟的优势，分子生物学技术的发展，为登革基因疫苗的研制提供了广阔的舞台.随着动物模型和多价疫苗定量系统的成熟和完善，以及登革热致病机制研究的不断深入，势必会加快登革疫苗的研究进程.

(2)RNA干扰

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制.将与靶基因的转录产物信使RNA(mRNA)存在同源互补序列的双链RNA(double strandRNA，dsRNA)导人细胞后，能特异性地降解该mRNA(信使RNA)，从而产生相应的功能表型缺失.这一过程属于转录后基因沉默机制范畴.RNA干扰广泛存在于生物界.从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制更为复杂.

RNA干扰作用机制

现已初步总结出RNA干扰的作用机制：细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，形成22bp大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA(小干扰RNA)可进一步掺入多部分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNA(小干扰RNA)序列互补的mRNA(信使RNA)，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.除此机制外，在果蝇及线虫的研究中发现，RNA干扰还可以通过影响染色质结构来调控基因的表达.因此从目前的研究结果来看，RNA干扰现象并不仅仅发生在转录后水平，而是在多水平影响着基因的表达.RNA干扰的基本过程分为三个步骤(文献：Nature,2004,431:343-349；Genes Dev,2005,19:517-529)：

siRNA(小干扰RNA)的形成：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式导入dsRNA(双链RNA)，dsRNA(双链RNA)在细胞内被Dicer酶切割成21～23碱基长的小分子双链干扰RNA片断：siRNA(小干扰RNA)，其结构特点为在3’末端有两个碱基凸出和5’末端为磷酸的双链RNA.