[发明专利]一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法

权利要求书

1.一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)γ-PGA-S72单体的合成：将γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室温下溶解于0.5M碳酸氢钠溶液中，待溶解完全后将反应液置于4℃的冰水浴中冷却降温，待冷却后加入缩合剂EDC·HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得γ-PGA-S72单体；

2)温敏水凝胶生物载体的制备：将NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去离子水中，NIPAAm和γ-PGA-S72单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3～5％和2～8％，20～25℃搅拌25～45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至0～4℃，加入质量百分比浓度为2～6％的交联剂搅拌均匀，在N₂保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.5～2％的引发剂水溶液，搅拌5～15min后，向混合液中加入促进剂50～120μL，搅拌30～60s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20～25℃，24～48h后停止反应；

3)温敏水凝胶生物载体的纯化：将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于去离子水中7～10天，每间隔6～8小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；

4)温敏水凝胶生物载体与生长因子的结合：将步骤3所得的温敏水凝胶置于体积浓度为75％的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS冲洗3次，制得结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。

2.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的N-异丙基丙烯酰胺单体分子结构中存在着一定比例的疏水基团异丙基-CH(CH₃)₂，以及亲水基团酰胺基团-CO-NH-，它们会竞争性地和水分子产生氢键作用力。在较低温度下及外界温度小于PNIPAAm的低临界溶解温度LCST≈32℃时，PNIPAAm与水分子之间的相互作用力主要体现为酰胺基团和水分子之间的氢键作用，此时分子链呈现伸展的线团构象，随着温度升高，当T＞LCST时，部分与水分子形成的氢键被破坏，PNIPAAm大分子内酰胺键之间会形成氢键，形成疏水层，将水分子排出。由于PNIPAAm在人体生理温度附近LCST≈32℃表现出优良的温度响应性，使得它在组织工程温敏支架材料中得到广泛的应用。

3.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键的方式缩合成的一种多肽型高分子，γ-PGA的分子链上含有大量的活性较高游离侧链羧基-COOH，使得它具有极好的吸水保湿性，易于与一些药物形成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的生物医用高分子材料。

4.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的γ-PGA-S72单体中磺酸基团-SO₃H和羧基-COOH的相对含量之比恰好适合与生长因子中阳离子氨基酸结合，从而对温敏水凝胶生物载体起到了增强生物相容性和保护缓慢释放生长因子的作用。

5.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺，所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的促进剂为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。

6.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的水凝胶溶胀后外观为透明状，当外界温度升至31～35℃后，水凝胶立刻由透明色变为乳白色。

7.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：根据上述结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，于37℃条件下凝胶表面接种小鼠胚胎成纤维细胞，细胞数量随γ-PGA-S72单体含量的增加而增加。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够通过水凝胶的亲疏水性自动脱附，从而避免了酶对细胞增殖和分化的影响。