[发明专利]一种PCR扩增引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种PCR扩增引物及其应用。

背景技术

香草兰原产墨西哥，属兰科攀缘藤本。香草兰是高级食用香料，有“食用香料之王”之称，豆荚含有2～3％的香兰素，广泛用于食品工业中。

香草兰发酵豆荚的最主要风味物质为香兰素，其中香兰素由其前体香兰素葡萄糖苷经豆荚自身携带的内源β-D-葡萄糖苷酶水解而形成。目前已分离到多种产β-D-葡萄糖苷酶的细菌。但是，从香草兰上分离的各种菌株不是都能分泌出的β-D-葡萄糖苷酶，这需要通过生物技术手段进行鉴定。

至今已有多项研究报道了β-D-葡萄糖苷酶基因的扩增引物序列，但是细菌中的蛋白编码基因变异度较大，不同菌种、不同来源的菌株其蛋白编码基因序列差异较大，扩增引物的适用范围有限，本领域关于分离自香草兰的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的性质还未有深入的研究，特别是针对这些菌株的β-D-葡萄糖苷酶基因的检测引物未见有报道。

因此，现阶段需要一种新型的生物技术手段用于检测枯草芽孢杆菌是否携带有β-D-葡萄糖苷酶基因，特别是分离自香草兰的枯草芽孢杆菌，以此来协助产β-D-葡萄糖苷酶的菌株的筛选工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种PCR扩增引物，使得所述PCR扩增引物能够扩增枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。

本发明的另一个目的在于提供一种PCR扩增引物，使得所述PCR扩增引物能够扩增分离自香草兰的枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。

本发明的另一个目的在于提供所述PCR扩增引物在制备检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因试剂盒中的应用以及一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供所述PCR扩增引物在检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的应用以及一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法。

为实现本发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种PCR扩增引物，由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成。

利用本发明提供的上下游引物对分离自香草兰的枯草芽孢杆菌基因组扩增，PCR扩增产物测序后，将测序所得序列去除前端和末尾序列片段，并将结果整理成FASTA格式的文件，采用NCBI数据库中的BLAST软件进行比对。结果显示，与扩增产物序列同源性高的均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)β-D-葡萄糖苷酶基因。表明本发明所述PCR扩增引物能够扩增枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。

基于此，本发明还提供所述PCR扩增引物在制备检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因试剂盒中的应用。优选地，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。

同时，基于上述应用，本发明提供一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的试剂盒，包括具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。

作为优选，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP和PCR buffer。

此外，本发明还提供所述PCR扩增引物在检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的应用。优选地，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。

基于上述应用，本发明提供一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法，用具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物对枯草芽孢杆菌的DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

作为优选，所述PCR扩增体系为：

2.0μL10×PCR buffer，200μM dNTP，80nM上游引物，80nM下游引物，1.0U Taq polymerase及0.8μL枯草芽孢杆菌DNA。

作为优选，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。

作为优选，所述PCR扩增程序为：

94℃3min；

94℃60s，60-67℃60s或54℃60s，72℃75s，共30个循环；

72℃保持10min。