[发明专利]一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用。

背景技术

土元，又名地鳖(ground beetle)、土鳖虫，系鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphaga sinesis Walker)或冀地鳖(Steleophage plancyi(Boleny))的雌虫干燥体，是一种传统中药，临床应用很广泛，最早记载于秦汉著作《神农本草经》，具有散血瘀、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。

土元传统的入药为原药材粉碎直接服用或加热水提、醇提后服用，其利用率低，且进入人体后带来的活性不高。目前，有人从土元中提取单一的蛋白制成制剂，但制成的口服制剂经过胃肠道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，活性大大降低；而制成注射液，大分子蛋白类又容易引起免疫原性，存在安全隐患。市面上已有治疗带状疱疹的土元干粉，用以镇痛，还尚未出现具有显著抗凝血活性的土元功能性产品，因此开发出一种低成本、高活性的土元产品具有广阔的市场经济效益。

本发明采用可控酶解的方法，通过生物蛋白酶对土元躯体蛋白进行水解催化作用，把其中隐藏的抗凝血活性肽片段释放出来，从而制备具有抗凝血活性的多肽。目前，对于生物活性肽的开发在国内外已成为热点研究领域，多肽高活性、快吸收、安全健康的特点广受产品开发者的青睐，目前已从可食蛋白中水解分离得到的有高F值寡肽、抗氧化肽、ACE抑制肽等，且多肽的开发所需仪器设备、生产条件简单可行，所以，酶解土元蛋白制备抗凝血活性肽具有很高的可行性和广阔的市场经济效应。

经查阅已有专利，申请号为“200810118148.X”的专利，其权利要求为一种土鳖虫的仿生酶解产物及其用途，将土鳖虫，加水匀浆，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即可得到产物。此专利中的发明主要采用胃蛋白酶和胰酶仿生酶解，制得用于治疗心脑血管、肿瘤、跌打损伤等的混合多肽类物质，未进行进一步地分离纯化，且对抗凝血活性的测定只用了PT单一指标。本专利采用高效的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，并用DA201-C大孔吸附树脂交换柱进行分离纯化，采用ATPP、PT、TT、FIB四项指标对多肽的抗凝血活性进行比较，活性检测更全面，所得多肽更纯，具有一定疏水性，分子量更小，与上述专利得到的多肽群不同，故并不影响本专利的申请。

申请号为“200610140160.1”和“200710046247.7”的专利，都是将土元干粉溶于水，加入模拟胃液进行酶解，酶解液过葡聚糖凝胶Sephadex G25层析柱，冷冻干燥，得多肽组分。此者主要采用模拟胃液将土元酶解，得到的酶解液经Sephadex G25柱分离后得到的产物体现出对带状疱疹的治疗功效，后者提出了一定的镇痛活性。本专利采用高效的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，过DA201-C大孔吸附树脂柱，得到的多肽产物表现出抗凝血活性，与上述专利得到的多肽群不同，并不影响本专利的申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用。本发明方法能够实现原料的高效利用，具有高活性、高安全、简单可控、环境温和的制备特点。

本发明的目的由以下方案实现：

(1)取土元洗净干燥，粉碎成细粉；加水溶解，细粉与水的比例为10～20g：100mL，pH调至8.0～11.0，以100～400r/min的速度均匀搅拌0.5h～4h以加速溶解，取上清液调pH至2～6，制得土元蛋白，再将pH调至4～8，干燥；(2)将步骤(1)得到的蛋白加水溶解，比例为5～20g：100mL，控制pH值在7.5～10，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，反应温度为30～70℃，以100～300r/min匀速搅拌1～4h；煮沸5～30min，灭酶活，结束反应；5000～10000r/min离心，收集上清液，干燥，得到粗多肽粉末。

(3)装柱：根据层析柱体积称取适量DA201-C大孔吸附树脂进行预处理后，装柱，层析柱规格2.6×60cm，待稳定后，用3倍柱体积纯净水(条件与洗脱时的相同)冲柱。