[发明专利]直接磺化法制备磺化丝素蛋白

说明书

技术领域：

丝素蛋白及磺化丝素蛋白属于天然高分子及其改性材料范围，也是常用的一种生物材料。 

背景技术：

通过查阅文献知晓磺化丝素蛋白具有抗凝血的性能，但在具体的重复实验中，发现此工艺的磺化效率并不高。于是尝试减少吡啶有机溶剂来提高磺酸的使用效率，并得到了直接磺化法的优化工艺参数及较纯净的磺化丝素蛋白产品。 

发明内容：

氯磺酸是所有无机酸中磺化效率最高的一种。在此，使用氯磺酸对丝素蛋白进行磺化改性，对磺化改性工艺的各参数采用正交法进行优化，寻找到了一种能明显提高磺化丝素蛋白抗凝效果的制备工艺参数。采用该工艺直接制备的磺化丝素蛋白，既降低了丝素蛋白的分子量又提高了丝素蛋白的抗凝血性能，及产品的可控性。 

具体实施方式：

磺化反应的温度、浓度及反应时间等工艺参数如下： 

浓度配比注释：1g丝素蛋白分别对应5、10、15ml氯磺酸的用量； 

温度条件：0、25、50℃； 

时间条件：5、10、15hr； 

用天平称取1.20g经脱胶的干燥丝素蛋白纤维，置入100ml的圆形单口烧瓶中，并用玻棒把丝素蛋白压至瓶底，再滴加6ml(见正交表)的氯磺酸溶液，旋转烧瓶使丝素蛋白被氯磺酸完全浸润，而后把烧瓶用真空旋塞通往装有CaCl₂干燥剂的干燥塔以除去丝素蛋白上丝氨酸、酪氨酸上羟基(-OH) 与氯磺酸反应所生成的水分，并置于50℃(见正交表)的油浴中，恒温磺化反应15小时(见正交表)。随后，缓慢、逐滴滴加5M的NaOH溶液(20gNaOH固体溶解于100ml容量瓶中即可配制)约36ml(1ml氯磺酸约消耗6ml5MNaOH溶液)，使之与残余的氯磺酸反应，直至反应溶液呈中性为止(同时也终止了氯磺酸对丝素蛋白的磺化改性)。待反应溶液冷却至常温后，用漏斗转移入留有足够膨胀空间的透析袋(34mm宽，500mm长)中，再把透析袋放入带蒸馏水及搅拌子的烧杯中搅拌透析72小时，以去除反应过程中产生的无机离子。 

通常24hr内透析袋会膨胀到最大体积，之后定时置换透析蒸馏水，直至透析液中的无机离子溶出竭尽为止(约72小时)。 

最后把透析袋中留下的磺化丝素蛋白溶液用旋转蒸发器(0.08MPa的真空度，50℃的水浴锅中)浓缩约3hr后，置于10cm的培养皿中(高度约5mm)，用冰箱预冷冻成冰块后，再置入冷冻干燥器冷冻干燥，得到所要的磺化丝素蛋白粉末(约0.12g)。 

进行APTT(活化部分凝血活酶时间)试验： 

分别取9种磺化改性丝素蛋白及丝素蛋白(对比样)冻干样品(共10个品种)各2mg，分别溶解于2ml的蒸馏水中形成浓度为1mg/ml的溶液；吸取各磺化改性丝素蛋白溶液300μl，与300μl的PPP(贫血小板血浆)混合均匀，置于24孔培养板的对应孔内，放置在37℃的水浴锅中孵化30分钟；再分别移取60μl混合液加入到ACL200自动凝血仪的样品杯中(2号杯放APTT试剂，3号杯放氯化钙试剂)；点击APTT测试模式，测得各改性工艺样品溶液的APTT(一次可测18个样品)、并记录、分析如下： 

氯磺酸磺化改性丝素蛋白正交实验表及APTT测试结果如下： 

可见，未使用吡啶溶剂，反应未在冰浴条件下进行的7号工艺(温度为50℃，浓度配比为5ml氯磺酸/g丝素蛋白，反应时间为15小时)制得的磺化丝素蛋白，其APTT数值也得到了明显的提高。 

附有丝素蛋白及9种磺化工艺制备的磺化丝素蛋白在剂量为10、100、300μg时的APTT测量值的柱状图(见附图：丝素蛋白与9种磺化工艺磺化丝素蛋白APTT对比图)。图中Platelet-poor Plasma(贫血小板血浆)；Silk Fibroin(丝素蛋白)；Sulfated Silk Fibroin(磺化丝素蛋白)；APTT(活化部分凝血活酶时间)。