[发明专利]一种抗病毒蚕药

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产兽药的技术领域。 

背景技术

蚕药是养蚕生产中不可或缺的物资，关系到养蚕生产能否稳产高产，在养蚕生产上起到了重要的作用。蚕药市场存在着品种单一、新创产品少等诸多问题，使蚕农在蚕药的使用上具有很大的盲目性，很难做到“对症下药”，这在一定程度上影响了养蚕的安全生产。目前养蚕生产中使用的蚕药主要以老产品为主，大多是2005年地方标准升国家标准时保留的品种，蚕药品种单一，环保、安全的新蚕药少。目前，包括病毒病在内的各种蚕病已经影响蚕茧产量、质量，每年因蚕病危害损失的蚕茧约为10％～20％，严重制约蚕业发展。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)引发的蚕脓病是家蚕三大病毒病中危害最严重的一种。该病传染性强、难以控制，经常在世界养蚕国家暴发，造成巨大的经济损失。每年在川、浙等主要养蚕区域由BmNPV引起的蚕茧损失占蚕病总损失的70％以上。 

胸腺素(thymosin)是一类由胸腺分泌的具有生物活性的多肽物质，可促进T细胞的成熟，同时参与神经内分泌系统和免疫系统的交互作用，激活细胞免疫，调节机体免疫力。近年来，胸腺肽作为一种免疫调节剂，广泛用于医学临床，特别是在病毒性疾病的防治中取得了较好的效果。家蚕胸腺素蛋白是胸腺素超家族(Thymosin superfamily)保守蛋白的成员之一，胸腺素超家族蛋白保守区序列与β族胸腺素(β-Thymosins，Tβ)有较高的同源性，在肌动蛋白动力学中发挥多种调节作用，通过调节肌动蛋白的动力学结构使得肌动蛋白骨架处在不断重塑的过程中，进而在细胞运动能力、成纤维细胞迁移、内吞作用中发挥重要作用。参与免疫和细胞生长的级联信号的相互传递。还与免疫调节、细胞迁移、血管生成、创伤愈合等有密切联系。但是利用基因工程技术表达家蚕胸腺素(Bmthymosin)制备提高家 蚕抗病毒能力的兽药尚未见报到。 

发明内容

本发明人首次利用家蚕自身的胸腺素基因(Bmthymosin基因)表达Bmthymosin蛋白，并进行纯化，再制成新型蚕药，发现其可以提高家蚕的抗病毒能力，有助于家蚕疾病的预防，提高养蚕的经济效益。 

本发明人在家蚕蛹cDNA文库筛选并得到一条编码Bmthymosin蛋白的基因序列，其ORF为399bp(如SEQ ID NO.1所示)，编码132个氨基酸残基(如SEQ ID NO.2所示)，生物信息学分析该基因编码的蛋白质含有胸腺素Thymosin保守结构域，说明该基因是家蚕胸腺素Bmthymosin基因，研究表明Bmthymosin与thymosin betas(Tβ)具有高度同源性，通过与G-actin蛋白结合调节肌动蛋白的组装，促进T细胞分化和成熟，有利于提高免疫能力，吞噬病毒颗粒，同时促进血管生成与伤口愈合，提高机体修复能力。 

本发明人为研究Bmthymosin基因的功能，构建了Bmthymosin原核表达载体，表达并纯化重组蛋白Bmthymosin，去除内毒素。分别以BmN细胞和家蚕5龄幼虫为对象，对重组蛋白Bmthymosin抗病毒作用进行了系统研究。 

本发明通过PCR的方法获得Bmthymosin融合基因，根据Bmthymosin基因的开放阅读框(ORF)序列设计扩增引物，在上下游引物中分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点，与pHelix-Bmthymosin质粒载体相连接后，以设计的引物扩增目的基因的ORF，凝胶回收纯化PCR产物。将PCR产物与表达载体pET-28a(+)都用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切反应。将连接产物转化到E.coli TG1感受态细胞中，并进行铺板培养。经过重组克隆的筛选与鉴定后，将重组并鉴定好的表达质粒pET-28a(+)-Bmthymosin转化大肠杆菌BL21(DE3)。经亲和层析、FPLC纯化、质谱鉴定并去除内毒素后的融合蛋白即为发明的蚕药，进一步实验证明其具有抗病毒作用。 

更具体地，本发明提供以下各项： 

1.家蚕胸腺素在制备用于提高家蚕抗病毒能力或用于治疗或预防家蚕的由所述病毒引起的疾病的药物中的用途。 

2.根据1所述的用途，其中所述家蚕胸腺素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

3.根据1所述的用途，其中所述家蚕胸腺素由SEQ ID NO.1的核酸序列编码。 

4.根据1所述的用途，其中所述病毒是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。 

5.根据1所述的用途，其中由所述病毒引起的疾病是蚕脓病。