[发明专利]不依赖信号序列的pIX噬菌体展示

说明书

本申请是申请日为2010年2月24日，申请号为201080013437.9，发明名称为“不依赖信号序列的pIX噬菌体展示”的申请的分案申请。

发明背景

用于蛋白鉴定、表征和修饰的组合方法的使用已经在学术和商业研发中取得了巨大成功。在这方面，丝状噬菌体或噬菌体展示技术已经铺平了第一个文库平台的道路，并依然占据主导技术的宝座。因此，噬菌体展示广泛应用于基础蛋白和应用蛋白的发现以及基于新蛋白的诊断剂和治疗剂的开发中，基于新蛋白的诊断剂和治疗剂是世界范围内增加最迅速的化合物类别。

组合噬菌体展示技术的原理是基于每个病毒粒子将在其表面仅展示由其蛋白外壳包裹的基因组编码的完全相同蛋白的性质所提供的基因型-表型关联。噬菌体粒子本身对许多理化条件高度耐受；因此，噬菌体展示与竞争组合技术相比提供在许多筛选方案中的优越通用性。

已经使用丝状噬菌体外壳的全部五种结构蛋白实现了异源多肽的噬菌体展示，但只有pIII展示和一定程度上pVIII展示获得了广泛使用(图1)。

当异源融合体仅是短肽时，使用基于噬菌体基因组的载体的多价展示系统是优选的，而对于需要折叠结构域的较大融合体而言，大多数应用将受益于噬菌粒系统。在后一情况下，截至目前，抗体-pIII噬菌体展示主导该领域，但替代支架即将出现，依然需要发展未来的蛋白工程工具。非常希望的应用是简单地通过噬菌体病毒粒子感染细菌从噬菌体展示文库有效获得高亲和力特异性肽或蛋白结合物而同时依然结合其靶。

Endemann和Model,1995(PMID:7616570)报道了次要外壳pIX对融合至其N末端的另一蛋白无功能性。因此，该报道得出pIX不能用于噬菌体展示的结论。

Gao等人(PMID:10339535、12239343和WO0071694)和Khalil等人(PMID:17360403)二者后来显示，当从噬菌粒表达并与信号序列依赖性周质靶向组合使用时，允许N末端pIX融合体展示。在这些系统中，由于在噬菌粒拯救时从辅助噬菌体基因组提供wt pIX而发生补充。

WO0071694图2A(未插入融合蛋白)和WO0071694图2B(插入融合蛋白)中公开的噬菌粒清楚地包含pelB信号序列(图文字在第7页，第2-14行)。

如上所述，之前已经表明，pIX对融合至N末端的另一蛋白无功能性，并且Gao等人提出其成功的单独的两个可能原因或两者组合。

一个可能的原因是原核前导序列(信号序列)N末端连接至融合蛋白，由此保证重组蛋白靶向周质空间，并从而防止在胞质中的累积。

另一个可能的原因是，如根据Endemann和Model，重组蛋白从噬菌粒而非噬菌体基因组表达，因此，来自噬菌粒拯救所必需的辅助噬菌体的野生型pIX补充重组pIX融合蛋白，由此保留了野生型功能性，否则野生型功能性可能由于重组修饰而丧失。即，噬菌体将包含野生型蛋白和融合蛋白的混合物。

Khalil等人(PMID:17360403)描述了利用双特异性丝状噬菌体病毒粒子特征的应用，其中外源性肽展示在完全相同的病毒粒子的每个远端。他们通过使用普通pIII噬菌体基因组载体补充原核信号序列依赖性pIX展示噬菌粒的组合来实现该目的。在这种情况下，噬菌体基因组载体用作拯救噬菌粒的辅助噬菌体。

发明概述

本发明的一个目的是提供用于在丝状噬菌体上展示的肽的替代支架。

本发明第一个方面是源自丝状噬菌体的pIX融合蛋白，所述融合蛋白不包含原核N末端信号序列并因此直接融合至外源性肽。

本发明另一方面涉及编码本发明融合蛋白的核酸。

本发明一个方面涉及包含本发明融合蛋白的丝状噬菌体。

本发明另一方面涉及丝状噬菌体文库。

本发明另一方面涉及包含噬菌粒和辅助噬菌体的噬菌体展示系统，其中所述噬菌粒包含编码本发明pIX融合蛋白的核酸。

一个方面涉及包含噬菌体展示系统的试剂盒，所述噬菌体展示系统包含噬菌粒和辅助噬菌体，其中所述噬菌粒包含编码本发明pIX融合蛋白的核酸。

附图简述

图1