[发明专利]芒果横线尾夜蛾tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种芒果横线尾夜蛾微管蛋白（tubulin）基因转录水平的荧光定量PCR检测试剂盒，属于分子生物学检测技术中的荧光定量DNA体外扩增技术领域。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)，即DNA体外扩增技术，PCR技术将模板DNA、特异引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA片段在反应液中呈2ⁿ倍扩增（其中n为热循环次数）。

荧光定量PCR是一种核酸定量技术，该技术在PCR反应系统中引入了特定的荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，从而获得每个反应管的Ct值（荧光变化达到阈值时的循环数），以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这种性质用于扩增产物的检测非常理想。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，当该染料掺入DNA双链后，荧光信号增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green I染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。这种高灵敏度、较低毒性的核酸染料在结合双链DNA分子后荧光增强800-1000倍。

    SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果的准确性。

    在荧光定量PCR检测基因表达水平时，经常检测某个基因的相对表达量，其中内参基因常常选择tubulin。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测芒果横线尾夜蛾tubulin基因表达量的引物和PCR反应条件，并组装成tubulin基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、植物保护研究者的检测需要。

发明内容

    本发明的目的是提供了一种芒果横线尾夜蛾tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，解决了现有技术中检测不灵敏，成本高等问题。

本发明的技术方案如下：

一种芒果横线尾夜蛾tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测引物，引物序列为：正向引物1：5＇- TTGATGAGGTCCGCACTGGC -3＇；

反向引物2：5＇- GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG -3＇。

2、一种芒果横线尾夜蛾tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由SYBR Premix Ex Taq^TM、引物混合物、标准tubulin基因模板和超纯水组成，试剂盒中各组成成分如下：

SYBR Premix Ex Taq^TM购自TaKaRa公司：包含Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg²⁺，Tli RNaseH，SYBRGreen I ； 

引物混合物：正向引物1为10 μmol/L、反向引物2为10 μmol/L；

标准tubulin基因模板：浓度为1.0 μmol/L，tubulin基因模板序列如SEQ ID NO:3所示；

超纯水组成：纯度不超过18.30 MΩ·CM。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明实现了方便快捷的检测tubulin基因转录水平的目的。

2. 本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。

附图说明