[发明专利]RT-PCR检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种用半定量RT-PCR法检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶转录水平的方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH/XO)是一种非特异性需氧脱氢酶,在嘌呤代谢过程中催化嘌呤代谢的最后两步，从黄嘌呤和次黄嘌呤形成尿酸代谢产物终产物尿酸，在尿酸的代谢过程中发挥着重要的作用，是体内尿酸代谢中一种非常重要的酶。

近年来随着人们生活水平的提高, 高尿酸血症的发病率逐年升高,且常与高血压、高脂血症及糖尿病等伴随出现。国内外文献报道, 高尿酸血症与冠心病、高血压、糖尿病、脑卒中等明显相关, 为其独立危险因子和重要的预后预测因子。痛风及高尿酸血症的研究正成为医药医学界的热点。无论是药物的筛选, 还是致病机制的研究, 都需要选择一种科学、合理的实验动物来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。

树鼩（Tupaia belangeri，tree shrews）的分类地位介于灵长目与食虫目之间，其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物更与人接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物在生物学研究中广泛应用。

为了利用亲缘关系与人类接近的实验动物——树鼩开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶mRNA 表达的相对定量方法，以研究药物作用树鼩体内黄嘌呤脱氢酶/氧化酶的转录水平变化，进而为研究黄嘌呤氧化酶功能及其影响因素打下基础。半定量RT-PCR因其费用低、普通实验室就能做到，而作为研究基因转录水平的有效手段,可用来检测基因表达及其变化状况。目前国内外还未见利用树鼩进行黄嘌呤氧化酶/脱氢酶转录水平半定量方法的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用半定量RT-PCR法检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，以在转录水平上对树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因进行半定量检测。

为实现上述目的，本发明通过下列技术方案完成：以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行PCR 扩增，得到XDH/XO基因片段的扩增产物的灰度值与内参基因GAPDH PCR扩增产物的灰度值之比, 根据所得灰度值之比即可计算出不同生理状况下XDH/XO mRNA的相对表达值，并根据所计算的相对表达值的大小半定量检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。

本发明具体方案是：一种半定量RT-PCR法检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：

1）设计下列引物：

树鼩XDH/XO基因表达水平的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：

XDH/XO F：5’-GTTGGAGGGAACATCATCACT-3’ 

XDH/XO R：5’-GCAGGGTCTTTCTGTAGCCA-3’；

  作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物及对应的核苷酸序列为：

GAPDH F：5’-CAAGAAGGTAGTGAAGCAGGC-3，

GAPDH R 5’-TGTTGAAGTCGGAGGAGACC-3’

2）以树鼩新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肝脏组织cDNA第一链；

3）以步骤2）逆转录合成的树鼩肝脏组织cDNA第一链为模板，以步骤1）中的XDH/XO F和XDH/XO R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别在下列PCR 扩增体系下：25μL 体系，Premix Taq 12.5μL，10μmol/L 正向、反向引物各1μL，cDNA 模板2μL，8.5μL 去离子水，进行下列PCR扩增：94 ℃预变性 5 min， 98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸1min，共35个循环， 72 ℃延伸 10 min，分别得到XDH/XO和GAPDH的扩增产物；