[发明专利]丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒及其制备

说明书

技术领域

本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒及其制备。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是诱发丙型肝炎的罪魁祸首，其通过血液传播。全世界约有1.7亿感染了HCV，其中中国有不下3800万的感染者，这个数字还在上升。与乙肝相比，丙肝更容易转成慢性，约有70％的丙肝患者发展成慢性肝炎，20％发展成肝硬化，12％发展成肝癌，危害严重。因此，目前，慢性丙肝除了干扰素有确切的疗效外，尚没有其它有效的治疗方法，而且疫苗的研制在短期内难有突破性的进展，因此，早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要的意义。

现在常规检测HCV的技术主要是抗体检测和RNA检测，各有缺陷。自1989年，HCV抗体诊断试剂确诊出第一例HCV阳性感染者以来，抗体诊断试剂已经发展到了第四代，尽管检测灵敏度在不断提高，但是窗口期(即从病毒感染起直到可以检测出该病毒标志物之前的时期)仍然存在，并成为输血安全的重大威胁之一。抗体检测也不能区分感染活动期患者和病情康复者，不能用于患者的疗效监测；RNA检测分为定性和定量两种，HCV RNA检测直接检测HCV病毒是否存在，其基本原理是转录聚合酶链反应(RT-PCR)。虽然RNA检测可以早期诊断HCV感染，而且特异性好灵敏度高，但该方法在设备和技术上要求较高，且人员需要专职培训，操作繁琐，假阳性高，因此难以在常规工作和基层实验室中推广，限制了其应用a

HCV病毒核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一，氨基酸序列十分保守，有研究表明其在血清中的滴度与HCV RNA水平密切地相关，而核心抗原与RNA动力学变化密切相关，因此可做为病程进展或抗病毒治疗的疗效监测的指标。HCV核心抗原的检测是一新型的检测方法，研究始于上世纪九十年代中期，应用最广泛的是酶免疫方法和化学发光法。美国Ortho公司已经推出了双抗体夹心>法定性和定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂盒，于2004年已经在欧洲上市，中国仅有湖南景达制药有限公司于2005年推出的核心抗原的ELISA检测试剂盒。中国专利CN101419238L公开了一种基于化学发光法的酶联免疫试剂盒，但该方法操作也较为繁琐，且灵敏度低，因此，发明一种既操作简便乂灵敏度高的试盒具有非常重要的临床意义。

丙型肝炎病毒核心抗原的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。

乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。

本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如：氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。

发明内容

为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。