[发明专利]一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法

权利要求书

1.一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其特征如下：

(一)所适用单抗有较高纯度，能识别非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位、激发峰在340nm附近而在280nm附近为激发谷的荧光半抗原，且不含有其它抗体或蛋白；

(二)所用滴定探针包括荧光探针和非荧光探针两类；非荧光探针为单抗所识别的非荧光半抗原、缺乏色氨酸连续抗原表位；激发峰在340nm附近且在280nm附近为激发谷的荧光团称色氨酸FRET接受体，对应荧光探针为色氨酸FRET接受体类荧光半抗原、上述非荧光探针与色氨酸FRET接受体荧光团的加合物；

(三)用滴定探针测定对应单抗的荧光滴定曲线；此滴定曲线测定过程的特征如下：

(1)取一定量中性磷酸盐缓冲液至荧光比色杯中，加入一定量单克隆抗体样品溶液混合均匀：用总容量为4.0ml的荧光比色杯时，混匀后液体总体积在2.0ml以上；用微量荧光比色杯时，混匀后液体总体积达到荧光分光光度计测定所含液体荧光信号的要求；

(2)准确称量所选滴定探针，用相同中性缓冲液直接溶解并稀释至不低于20μM，有强吸收探针用吸收标定浓度；或用二甲亚砜、二甲基甲酰胺等溶剂配制成浓度不低于2.0mM储备液，再用相同中性缓冲液稀释到20μM；滴定使用之前再稀释到2.0μM或所需浓度；

(3)取5～20μL探针溶液加入荧光比色杯内单抗溶液中，温和摇匀后静置反应3～10分钟；用非荧光探针滴定时，280nm激发测定340nm荧光信号；用荧光探针时280nm激发测定340nm荧光信号或荧光探针自身特有发射峰下荧光信号；用丹磺酰胺为色氨酸FRET接受体时，测定在540nm附近荧光信号；荧光信号稳定后记录在所选波长下的荧光信号；

(4)继续取5～20μL探针溶液加入相同荧光比色杯内含待测单抗的溶液中，温和摇匀，静置3～10分钟后测定所选波长下的稳定荧光信号；重复操作到加入探针后所测荧光信号相对变化小于1％或滴定探针累积浓度达到据其蛋白量换算所得抗体活性位点浓度10倍；

(5)按照信号和各种物质的浓度成正比的原则，校正加入的滴定探针溶液对单抗起始浓度C₀的稀释效应、对荧光信号的降低效应；

(四)用Matlab类软件或自编程序，按如下公式拟合滴定曲线测定单抗的位点浓度：

(1)定义如下的变量和符号：

(2)据探针和单抗可逆结合平衡、各成分荧光信号线性加、同时考虑动态及静态猝灭得：

Cx=(C0+x+Kd)-(C0+x+Kd)2-4×C0×x2---(1)]]>

F=S1×(C0-Cx)1+Ksv×(x-Cx)+S2×Cx1+Ksv×(x-Cx)+S3×(x-Cx)+Fb1+Ksv×(x-Cx)---(2)]]>

(3)当测定荧光探针特有发射信号时确定滴定反应体系的单抗起始浓度C₀有两种方法：

(a)选择滴定曲线起始阶段的数据得到针对初始滴定数据的渐近线；选择接近饱和结合的数据得到探针饱和结合后的渐近线；两条渐近线延长线的交点在横坐标轴上对应的探针总浓度，是滴定反应体系单抗起始浓度C₀的近似值；

(b)实验测定S₃，用Equ.(2)拟合滴定曲线得到最优拟合对应的C₀为所需参数；

(4)测点单抗340nm荧光信号时起始信号等于(C₀×S₁+F_b)，即F_b与C₀、S₁之间有协方差，这使得用Equ.(2)拟合滴定曲线时拟合不收敛；用如下拟合策略可消除此协方差：

(a)先用Equ.(2)拟合某条滴定曲线获得决定系数高于0.99的拟合方程；从拟合方程推算其一阶导数；以一阶导数的最大值，即x趋近于零时的一阶导数，作为S₁的近似值；

(b)设定F_b为零，并将S₁固定在其近似值，再用Equ.(2)拟合相同的滴定曲线，获得对应最佳拟合的唯一C₀作为待测单抗的起始位点浓度。

2.据权利要求1所述一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其有如下应用特征：

(1)非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位能直接作为探针用于滴定单抗活性位点；应用此类非荧光探针需测定340nm荧光信号，对应要求被分析的单抗样品中无其他蛋白或其它抗体或小分子产生的340nm荧光信号，从而使得本底荧光信号Fb为零；

(2)用荧光探针，即适合作为色氨酸FRET接受体荧光团与非荧光探针的加合物及适合作为色氨酸FRET接受体的荧光半抗原本身作为探针，可测定单抗在340nm荧光信号或者这些色氨酸FRET接受体特有荧光信号监测滴定过程获得滴定曲线；用Equ.(2)拟合分析用此类探针测定的色氨酸FRET接受体特异荧光信号能承受样品中的本底信号，同时还能同步确定探针与单抗的亲和力K_d，故应用这种探针还能筛选针对所用半抗原的高亲和力单抗；

(3)此方法所测单抗位点浓度对纯化单抗所含色氨酸的相对丰度变化有抗性。