[发明专利]基因工程改造蛋白酶K及其生产方法

权利要求书

1.基因工程改造蛋白酶K，其特征在于：将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列在如下位点进行相应的突变：

N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337N和P355S。

2.一种如权利要求1所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，包括如下操作步骤：

S1:目的基因的获取；

S2:高效表达载体的构建；

S3:高效表达载体的诱导表达；

S4:活性检测；

S5:小规模的高密度发酵；

S6:高密度发酵产品的检测及产率活性分析；

S7:发酵规模放大至中试规模；

S8:酶的分离纯化；

S9:少量产品的分离纯化；

S10:发酵规模扩大；

S11:产品的生产。

3.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：

步骤S1中合成目的基因后利用SalI酶切后线性化，通过电转化到毕赤酵母细胞中，配制四个G418浓度梯度的YPD筛选平板；进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取70个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号；每个克隆均做4个梯度的筛选，利用PCR方法确定拷贝数。

4.如权利要求2所述基因工程改造蛋白酶K的生产方法，其特征在于：发酵过程中所用的各培养基为：

种子培养基：YPD液体培养基；

发酵培养基：无机盐培养基及4.35ml/LPTM₁微量元素溶液，初始发酵pH5.0；PTM₁微量元素溶液的组分为：CuSO₄·5H₂O6.0g/L，KI0.08g/L，MnSO₄·H₂O3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L，FeSO₄7H₂O65.0g/L，Biotin0.2g/L，H₂SO₄5.0ml/L，混匀过滤除菌，4℃避光保存；

甘油补料培养基：甘油50％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液；

甲醇补料培养基：甲醇100％，4.35ml/LPTM₁微量元素溶液。