[发明专利]制备克隆小型动物胚胎的方法

说明书

本发明公开了制备克隆小型动物胚胎的方法，其包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；将去核卵母细胞与供体核细胞融合，以便获得重构胚；将重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将激活的重构胚进行培养，以便获得克隆小型动物胚胎。采用本发明的方法，能够在消化卵母细胞透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。

技术领域

本发明涉及动物细胞工程技术领域。具体地，本发明涉及制备克隆小型动物胚胎的方法。

背景技术

体细胞核移植又称克隆，是动物细胞工程中最常用的技术手段。通过电击法或直接显微注射法将具有较高分化程度的体细胞转移至卵母细胞中，再经过化学激活，使其重新编程发育成胚胎，将其移植入代孕母体内，出生完整个体。1996年通过传统克隆技术，在显微操作仪器辅助下，首次获得的体细胞克隆绵羊。2001年，科学家Gavor Vajta首次提出了手工克隆技术，该技术在体视显微镜下，手持特制刀片将无透明带卵母细胞的核切除，从而达到去核目的。手工克隆与传统克隆相比，无需使用显微操作仪，及尖端的技术人员。但这些技术方法主要适用于大动物。

因而，现阶段适于小型动物的手工克隆技术的研究具有重大的意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种适于小型动物，并能够有效保证囊胚形成率的手工克隆技术。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备克隆小型动物胚胎的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚；将所述重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所述克隆小型动物胚胎。发明人惊奇的发现，采用本发明的方法，能够在透明带为半消化状态，即在消化透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。此外，根据本发明的实施例，本发明的方法成本低、操作简单，易于推广。

根据本发明的实施例，本发明制备克隆小型动物胚胎的方法还可以进一步具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细胞松弛素B的至少一种。由此，能够有效消化透明带，便于精准的把握去核时间，易于去核操作。

根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：5-15μg/mL链蛋白酶；和/或1-5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果较好，易于去核操作。

根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：10μg/mL链蛋白酶；和/或2.5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果好，易于去核操作。

根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中进一步包含：5-15体积％的TCM199培养基；0.1-0.3mg/mL碳酸氢钠；0.1-0.3mg/mL丙酮酸钠；3-4mg/mL赫佩斯钠盐；2-3mg/mL赫佩斯酸；0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25体积％的牛血清。由此，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。

根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：10体积％的TCM199培养基；0.17mg/mL碳酸氢钠；0.20mg/mL丙酮酸钠；3.60mg/mL赫佩斯钠盐；2.63mg/mL赫佩斯酸；0.20mg/mL谷氨酰胺；以及20体积％的牛血清。由此，去核过程中，卵母细胞损伤小，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。