[发明专利]从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，以及胞壁酸的薄层层析检测方法。

背景技术

胞壁酸是细菌细胞壁中肽聚糖的组成成分。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧细菌，棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或成八字排列，菌体0.7～0.9微米×1.0～2.5微米，革兰氏阳性，无芽孢，可用于微生物发酵工程生产谷氨酸并进而制取谷氨酸钠(味精)。谷氨酸发酵废醪菌渣是味精工业的主要副产品,每年产量可达上百万吨，主要用作肥料和饲料加工，价格低廉。以谷氨酸发酵废醪菌渣为原料，检测并提取纯化胞壁酸，可大幅度提升综合利用价值，提高经济效益和社会效益。目前尚未见到以谷氨酸发酵废醪菌渣为原料提取纯化胞壁酸的报道。发明内容

本发明提供了一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取纯化胞壁酸的方法，本发明还提供了一种胞壁酸的薄层层析检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法，步骤如下：

1)取新鲜谷氨酸棒状杆菌菌渣(谷氨酸发酵废醪菌渣，即原料菌渣)，放在容器中，先用质量浓度为0.9％的生理盐水在室温多次(2～5次)洗涤菌渣，以除去异臭味和易溶物质，过滤，得滤渣；

进一步地，用生理盐水洗涤后，若滤渣还有异臭味，则向滤渣中加入蒸馏水，在温度55℃并伴随搅拌下洗涤菌渣(可通过恒温磁力搅拌器实现)，洗涤2～5次，过滤，得滤渣；

2)将步骤1)所得滤渣放入封闭容器，加入原料菌渣质量3～5倍的质量浓度为10％的三氯乙酸溶液，在温度45～60℃下，搅拌15min～1h(可通过恒温磁力搅拌器实现，搅拌速度优选中速)，以裂解菌体,去除磷壁酸，过滤，得滤渣；

3)将步骤2)所得滤渣用蒸馏水洗涤1～2次，以除去三氯乙酸，然后依次用原料菌渣质量2～10倍的甲醇、甲醇-氯仿混合液(甲醇、氯仿按体积比1:1混合而成)、氯仿洗涤脱脂，各2次；得脱脂滤渣；

4)向步骤3)所得脱脂滤渣中加入浓度为5～8mol/L的盐酸，按每克原料菌渣加入4～10毫升盐酸，置于水浴中，在温度90～100℃下酸解4～8h；酸解后，得棕黑色的酸解液，将酸解液在真空旋转蒸发仪上浓缩蒸干(50～65℃)，以尽量挥去盐酸，得胞壁酸粗品；

优选的，所述将酸解液在真空旋转蒸发仪上浓缩蒸干的温度为50～65℃；

5)步骤4)所得胞壁酸粗品，用蒸馏水溶解，加入氯仿，剧烈震荡摇晃，静置分液，弃去下层有机相(有机相中含有亲脂性和两性的杂质)，再加入氯仿萃取1～3次，得上层溶液；

优选的，所述蒸馏水的用量为原料菌渣质量的2～4倍，氯仿用量为蒸馏水体积的5～10倍；

6)将步骤5)所得上层溶液蒸发挥干，用甲醇溶解，加入活性炭混合吸附1～3次，至溶液变为无色透明，即得胞壁酸溶液，浓缩干燥，得胞壁酸；

优选的，所述活性炭选用型号303糖用活性炭，每次的活性炭用量为原料菌渣质量的0.5～1.5倍。

一种胞壁酸的薄层层析扫描检测方法，步骤如下：

1)取待检测样品液(即上述方法制备得到的胞壁酸溶液)，点样于高效薄层硅胶板上，同时，将不同浓度的标准液点样于同一块高效薄层硅胶板；展开剂加入展开缸中进行预平衡，后将高效薄层硅胶板放入展开缸中进行二次展开，取出晾干；

所述高效薄层硅胶板选用10cm×10cm的GF254高效薄层硅胶板；

所述待检测样品液的点样量为10μL/点；

所述标准液为5种不同浓度的标准液，浓度分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mg/ml，点样量为1μL/点；

所述展开剂为甲醇-丙酮-乙酸-水-异丙醇混合液，其中，甲醇、丙酮、乙酸、水、异丙醇五者的体积比为4～6：2～4：0.5～1：0.5～1：0.5～2；

所述展开剂预平衡和硅胶板展开过程的温度为25℃，20分钟，二次展开，每次展距8cm(每次都是从原点计)。

2)将质量浓度为1％的茚三酮乙醇溶液喷到高效薄层硅胶板上进行烘烤染色；

进一步地，所述染色的烘烤温度为110℃，时间5min；

3)利用薄层扫描仪进行薄层层析扫描，得到胞壁酸Rf(比移值)和峰面积积分值；同时，计算出标准液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中胞壁酸的质量浓度。