[发明专利]类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的快速检测体系及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的快速检测体系及检测方法。

背景技术

ERECTA编码的蛋白是属于富含亮氨酸重复蛋白类受体激酶家族，在花药发育早期的细胞分化作用中是冗余的，也影响着花药的发育，其突变体表现为雄性不育。在拟南芥突变体erecta中，位于第27个外显子的3067bp的位置C-T突变，导致其435位的丝氨酸变为苯丙氨酸。

目前针对ERECTA基因第27个外显子单碱基突变的研究除了直接测序外，已建立了两种检测方法：

(一)           PCR-SSCP法：该方法是PCR技术与SSCP技术的结合，其过程是：1）PCR扩增目的DNA；2）将特异的PCR扩增产物变性，在快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；3）将适量的单链DNA分子进行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳；4)最后通过放射性自显影、银染或溴化乙钉显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。

该方法快速、灵敏、简便，不需要特殊分仪器，适合临床实验的需要。但它也有不足之处，例如只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需要进一步测序；电泳条件要求较严格；有假阳性出现。

(二)           聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法：该技术基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此技术提高了产物的含量和相对特异性，而且方法简单，时间短。PCR-RFLP法标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。但是在多倍体植物中的应用有一定的局限性。另外，PCR-RFLP法标记需要使用内切酶，增加了实验成本，限制了该技术的广泛应用。

所以，建立一种经济、快速、准确的检测拟南芥基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的分子技术方法是非常必要的。

发明内容

本发明目的之一是提供一种类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的快速检测体系。

目的之二是提供一种快速检测方法。

本发明通过以下技术方案实现，本发明的具体步骤：

一种快速检测类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的体系，其主要的特征在于该体系以水为溶剂，体系如下：

一种快速检测类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的方法，采用根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于该方法的步骤，将上述体系进行PCR反应，反应程序为：

本发明采用多引物PCR技术结合PCR错配技术建立了一种快速检测类受体蛋白激酶合成基因ERECTA第27个外显子单碱基突变的体系和方法。该检测体系及方法低成本、简便、快捷的分子生物学检测手段，为利用分子标记进行拟南芥的标记提供了有效的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例中采用的拟南芥的10个个体电泳检测结果图。

具体实施方式

1、材料的获得及样品采集：本例采用野生型拟南芥erecta拟南芥（母本）和Col（父本）杂交后F2代作为研究对象，用于单碱基突变检测。所有实验样品均为拟南芥叶片，每株取样12μg，放入-70℃保存备用。

2、提取拟南芥基因组DNA，可立即进行PCR扩增或-20℃长期保存备用。

3、PCR反应：1）引物的设计，本发明所涉及的引物，以及引物的序列、长度、退火温度以及特异性扩增产物的长度均在下表列出。引物由上海生工有限公司合成。引物序列及信息如下表：

注：F代表正向引物，R代表反向引物。扩增产物的长度为373bp。

2)PCR反应体系：所用的体系为15μl具体参数见下表：

3）PCR反应程序设定为：94℃，2min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；28个循环；72℃，10min；10℃，1min。

4、结果与分析：用1%琼脂糖凝胶电泳，160V，电泳20分钟，凝胶成像系统进行检测分析。红色M为Marker由康为世纪生物公司提供。