[发明专利]一种实时热启动Taq酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种实时热启动Taq酶及其制备方法。

背景技术

热启动Taq酶已越来越多地被用于PCR之中，特别是在多位点基因复合扩增，如人或动植物的微卫星基因，也叫短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析中用的更多，因为这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是：酶活是在反应体系由高温（95℃）降至退火温度的过程中释放恢复的，也就是说;是在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR的，所以这种DNA扩增是一种更严谨真实的扩增，杂带更少，本底更少，噪音更低，扩增效率更高^[1]。到目前为止，制备热启动Taq酶的方法有；1、石蜡包被法，2、抗体介导抑制法, 3、化学修饰法, 4、ssDNA链（适配子）结合法，5、肝素盐法。在我国有关研究热启动DNA聚合酶的报道文章还很少，更未见过用噬菌体展示肽亲和配体（或短肽）结合普通Taq酶，来制备热启动Taq酶的报道。用短肽制备的热启动Taq酶与常规意义上的热启动Taq酶还有所不同，它无需95℃预热十几分钟，而是像普通Taq酶一样直接进入PCR循环，缩短了反应时间。同时，短肽热稳定性好，它的热启动不是反应初始阶段的一次性热启动，而是在整个PCR的每个循环中的热启动。短肽与抗体相比较，分子量小得多，稳定性好，短肽可以通过胰蛋白酶水解Taq酶亲和性噬菌体而获得，也可直接通过人工合成来制备，免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化……等一系列繁琐的抗体生产程序，也降低了成本。选到的噬菌体表面展示肽亲和配体及其肽序列可以一直沿用，一次投入终生受用。同时短肽对整个PCR反应体系的影响也小的多热启动Taq酶已越来越多地被用于PCR之中，特别是在多位点基因复合扩增，如人或动植物的微卫星基因，也叫短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析中用的更多，因为这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是：酶活是在反应体系由高温（95℃）降至退火温度的过程中释放恢复的，也就是说;是在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR的，所以这种DNA扩增是一种更严谨真实的扩增，杂带更少，本底更少，噪音更低，扩增效率更高^[1]。到目前为止，制备热启动Taq酶的方法有；1、石蜡包被法，2、抗体介导抑制法, 3、化学修饰法, 4、ssDNA链（适配子）结合法，5、肝素盐法。在我国有关研究热启动DNA聚合酶的报道文章还很少，更未见过用噬菌体展示肽亲和配体（或短肽）结合普通Taq酶，来制备热启动Taq酶的报道。用短肽制备的热启动Taq酶与常规意义上的热启动Taq酶还有所不同，它无需95℃预热十几分钟，而是像普通Taq酶一样直接进入PCR循环，缩短了反应时间。同时，短肽热稳定性好，它的热启动不是反应初始阶段的一次性热启动，而是在整个PCR的每个循环中的热启动。短肽与抗体相比较，分子量小得多，稳定性好，短肽可以通过胰蛋白酶水解Taq酶亲和性噬菌体而获得，也可直接通过人工合成来制备，免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化……等一系列繁琐的抗体生产程序，也降低了成本。选到的噬菌体表面展示肽亲和配体及其肽序列可以一直沿用，一次投入终生受用。同时短肽对整个PCR反应体系的影响也小的多。

发明内容：

本发明的目的是提供一种实时热启动Taq酶及其制备方法，它可以取代金牌Taq酶，淘选到的具有表面展示肽亲和配体的噬菌体及其亲和配体肽序列可以一直用于该实时热启动Taq酶的制备，一次投入终生受用。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它通过噬菌体表面展示肽技术，从噬菌体展示肽库中淘选出一种与Taq酶有亲和性，而且在65℃以下这种亲和性都很稳定的阳性噬菌体，通过扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理并经过超滤而得到含有亲和配体肽的滤液；进一步分析该噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这一多肽配体，两种配体可各自按一定比例与Taq酶混合。

它的制备方法如下：1、用Taq酶蛋白包被酶标板，通过噬菌体表面展示肽技术，生物淘选使与Taq酶具有亲和性的噬菌体富集；

2、利用ELISA法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，再通过提高ELISA法中洗涤缓冲液的温度，筛选出与Taq酶在65℃以下亲和性稳定的阳性噬菌体，扩增该噬菌体并用胰蛋白酶处理之，再通过超滤得到含有亲和配体肽的滤液；

3、或分析筛选到的噬菌体表面展示肽亲和配体的序列组成，人工合成这段配体的序列肽；