[发明专利]人胰岛素及类似物或偶联物体外生物活性测定方法

说明书

本发明涉及一种人胰岛素及类似物，包括速效胰岛素如门冬胰岛素(Insulin aspart)、赖脯胰岛素（Insulin Lispro）、赖谷胰岛素（InsulinGlulisine）；长效胰岛素如甘精胰岛素（Insulin glargine）、地特胰岛素(Insulin Detemir)、德谷胰岛素（Insulin Degludec）以及修饰偶联物如聚乙二醇化胰岛素及类似物PEG‑Lispro（PEG conjugated insulin lispro）和PEG‑Insulin（PEG conjugated des B30‑insulin）的体外细胞法的生物效价测定方法及其应用。该发明采用雄性大鼠前脂肪细胞经体外诱导成脂肪细胞后，采用葡萄糖氧化酶法测定脂肪细胞的培养液中葡萄糖经胰岛素作用下的消耗量，计算相应的胰岛素生物效价。

技术领域

本发明属于人胰岛素及类似物或偶联物体外生物效价测定检测技术领域，包括速效胰岛素如门冬胰岛素(Insulin aspart)、赖脯胰岛素（Insulin Lispro）、赖谷胰岛素（ Insulin Glulisine），长效胰岛素如甘精胰岛素（Insulin glargine）、地特胰岛素(Insulin Detemir) 、德谷胰岛素（Insulin Degludec）以及修饰偶联物如聚乙二醇化胰岛素（如PEG-Lispro，PEG-Insulin）和PEG-Insulin（PEG conjugated des B30-insulin）的体外生物效价测定方法及其应用。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质刺激而分泌的一种蛋白质激素，胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素。胰岛素主要促进肝细胞、肌细胞、脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进肌肉、脂肪组织等靶细胞的细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞，转变为脂肪酸作为糖原贮存，同时加速氧化葡萄糖为高能磷酸化合物作为能量的来源，从而使血糖水平下降，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。胰岛素作为糖尿病治疗的主要药物，可有效调节人体血糖水平。

胰岛素制剂根据胰岛素作用起效的快慢、持续时间的长短，可以分为三大种类：（1）速效人胰岛素类似物：包括门冬胰岛素、赖脯胰岛素和赖谷胰岛素 ；（2）中效胰岛素：包括普通胰岛素、中性胰岛素；（3）长效人胰岛素：包括甘精胰岛素、地特胰岛素和德谷胰岛素。为了适应不同糖尿病人的治疗需要，其中有的短中长效制剂或加入辅助治疗制剂（鱼精蛋白、锌离子）或进行不同比例的预混型胰岛素提高其治疗效果。

人胰岛素及类似物或偶联物注射液能实现不同时间内的有效控制血糖的水平，如制品中效价测定不准确，会产生低血糖反应症状，人胰岛素及类似物或偶联物药物治疗研究过程中生物效价准确性尤为重要。目前国际上针对人胰岛素及类似物或偶联的生物效价测定是动物体内法，主要包括小鼠和家兔的体内血糖浓度变化的生物效价分析方法，如中国药典的双交叉小鼠法和美国药典的家兔降血糖法。胰岛素的生物效价目标单位定义法为：家兔注射最小质量人胰岛素，血糖值达到2.5mmol/L为1单位效价。各种短中长效人胰岛素及制剂的生物效价均采用此定义法表示，测定时用胰岛素效价标准品进行交叉比对计算而得效价，常规制剂中每ml注射液按100单位标示，而非质量来标示，在胰岛素原料和制剂中，由于尚无有效可靠的体外细胞法来分析检测生物效价的方法，常用已知1单位效价的质量反应生物效价。如普通胰岛素的1单位效价相当于0.03846mg，地特胰岛素的1单位效价相当于0.142mg，由于胰岛素属于生物制品，特别在制剂中可能出现因物理、化学等影响稳定性的因素，造成生物效价的改变，如单独用质量换算而成的生物效价会出现明显误差，因此，人胰岛素及制剂需要建立一种体外准确生物活性或效价的分析测定方法。