[发明专利]拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物组培方法，具体涉及一种拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，属生物技术领域。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科拟南芥属，具有显花植物的全部特征，并且有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、白花授粉等优点，被称为“植物界的果蝇”、分子生物学研究的模式物种。拟南芥基因组小，许多基因是单拷贝的，所以基因比较容易克隆和分析。因此，在植物基因工程和作物遗传改良上愈来愈受到重视。许多作物的基因功能验证都选用了拟南芥这种模式物种。

选用拟南芥进行基因功能验证试验中，侵染后收获的大量拟南芥种子必须经过多次的抗生素筛选才能获得抗性植株。在这过程中大量的工作都集中在培养基的配制和接种上，尤其是培养基的配制，需要添加一些能抑制农杆菌生长的抗生素，这些抗生素不耐高温高压，只能通过过滤灭菌后才能加入培养基中。通常情况下是，培养容器和培养基经过高温高压灭菌后，冷却到40℃-50℃，再加入经过过滤灭菌后的抗生素，然后分装到培养容器，冷却凝固后备用。以上工作程序繁锁、工作量大。如果能找到一种无需高温高压、又能抑制农杆菌生长、同时还不影响拟南芥正常生长的培养基，就可以解决以上问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的拟南芥遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌介导转化、培养基配制、筛选培养、抗性苗检测，其特征在于：

1、抑菌剂的配制：称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20％的次氯酸钠溶液100ml，加20g丙酸钙，再加成熟蒜头汁液20ml，用蒸馏水定容到200ml；即为抑菌剂；

2.培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1‰～2‰(Ｖ/Ｖ)的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；

3.农杆菌转化：选择携带HYG基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制备转化菌液；所述导入方法和转化菌液制备方法参照申请号为201110435405.4的发明专利“一种提高农杆菌介导的甘蔗GUS瞬时表达率方法”；培植拟南芥植株，当侧苔形成1～2个角果时，将拟南芥植株的地上部分浸入OD₆₀₀＝0.8的转化菌液中，侵染20～40s，然后用薄膜覆盖，于黑暗处放置过夜后，揭开薄膜，继续培养拟南芥植株，当植株的角果枯黄、欲开裂时，收获种子，干燥条件下保存待用；

4.筛选培养基配制：筛选培养基为MS+30mg/L潮霉素+0.4～0.5ml/L抑菌剂+30.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先不加潮霉素和抑菌剂，按配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，冷却到40～50℃，然后，按培养基配方添加潮霉素和抑菌剂，混匀后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却凝固后备用；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；

5.筛选培养：将步骤3收获的种子，在10％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，用无菌水冲洗3次后，将拟南芥种子重悬于无菌水中，散播到筛选培养基上；4℃黑暗春化3d，然后在培养室温度为22～25℃，光照12h，光照强度为1200lx条件下培养；当获得的抑菌培养植株长出2片真叶时移栽到土壤中，培养至成熟，单株收获种子；

6.抗性苗检测：取筛选后成活的抗性苗叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。

本发明的应用效果：

1、本发明的培养基中不同抑菌剂浓度对拟南芥种子污染的影响：我们设计了6种抑菌剂浓度的对比试验，结果如表1所示。试验结果表明，以抑菌剂浓度为0.4ml/L和0.5ml/L为好，种子污染率均为0。抑菌剂浓度为0.6ml/L，虽然污染率为0，但是它的苗生长明显受到抑制，根短，苗弱。抑菌剂浓度在0.3ml/L以下，种子出现不同程度的污染。因此，适合的抑菌剂浓度范围为0.4ml/L-0.5ml/L。

表1培养基中不同抑菌剂浓度对拟南芥种子污染的影响