[发明专利]一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用

权利要求书

1.一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： （1）、菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d；用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液，血球计数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草（Ophiocordyceps sobolifera）022007-9号菌株；  （2）、发酵培养：将孢子浓度为6×10⁷的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm/min，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨5g/ L，蔗糖20g/ L， KH₂PO₄ 1g/ L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/ L，溶剂为蒸馏水； （3）、发酵液的处理：经过步骤（2）发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12 000 rpm／min离心30 min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，后在4℃下，12 000 rpm／min离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目； （4）、硫酸铵盐析：将步骤（3）用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60%，搅拌半个小时，静置过夜，后在4℃下，12 000 rpm／min离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：步骤（5），将经过步骤（4）溶于灭菌蒸馏水的沉淀分别依次进行Sephadex G-15 柱层析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-50 柱层析分离纯化得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-15 柱层析方法为：将经过步骤（5）的硫酸铵盐析后沉淀溶于灭菌蒸馏水的1mL样品上样于2.6×10 cm 的Sephadex G-15 柱，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL／min，检测波长为280_nm，收集第II个活性峰组分并获得得样品II。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析的步骤包括：将经过Sephadex G-15 柱层析后活性峰组分II样品1mL上样于2.6×10 cm的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，流速3 mL／min，检测波长280_nm；分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1 mol／L NaCL，pH 6.5的缓冲液进行洗脱，收集第1峰活性组分获得得样品1。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-50 柱层析是将经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析后活性样品1的1mL样品上样于1.6×30 cm 的Sephadex G-50 柱，以0.05 mol／L NaCL ，pH 6.5的缓冲液作为流动相洗脱，流速0.4mL／min，检测波长为280_nm，收集所示标记为G1组分。

6.根据权利要求1-5之一获得的抗菌肽制品在医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品的用途。