[发明专利]人源EGF结构域蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及人源EGF结构域蛋白及其在制药中的应用。

背景技术

革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。由于细胞壁结构的不同，在革兰氏染色过程中，不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同(阳性菌为紫色)。革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表，还有变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属等等。该类细菌的致病能力往往与其细胞壁的特殊组分——脂多糖(又叫内毒素)相关。在人体当中，脂多糖会诱导机体产生大量细胞因子并激活免疫系统，最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。例如红肿就是细胞因子大量产生并释放导致的。

在革兰氏阴性菌感染的治疗中，除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外,还需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素。这些抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，而且对于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌等常见革兰氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。除了抗生素以外，如前列腺素合成酶抑制剂、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，临床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性已经从单类耐药发展成为多重耐药,使大量原本能够有效替代的二线抗生素无效。其次，抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导内毒素的产生，增加了疾病的治疗难度，所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先进的支持疗法出现，革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题，尤其是其20～30％的死亡率更是令人难以接受。据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后发生的一系列毒性反应的主要病源物。虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果，但对已游离于血液中的脂多糖以及由其持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力，所以临床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。第三，因为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁表面，使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。基于这些原因，近年来人们正在积极开拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽多数具有热稳定性、强碱性及广谱抗菌等特点。目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约2000多个AMPs，这些AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用，被认为是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的APMs成为研究的热点与难点。

EGF结构域(EGF-like domains，表皮生长因子样结构域)是在进化上相对保守的蛋白结构域，因其首次在表皮生长因子(epidermal growth factor)中被发现而得名。EGF结构域通常包含30-50个氨基酸残基，目前人们已经在大量的动物蛋白中发现该结构域。例如：人凝血因子Ⅶ(human factorⅦ，hFⅦ)。hFⅦ是人体天然存在的蛋白，分子量约为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla结构域)，两个EGF结构域(EGF1、EGF2)和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。其中人凝血因子Ⅶ-EGF1结构域(hFⅦ-EGF1)大小约为3.9kD。人源中还存在着与hFⅦ-EGF1序列相类似的多种物质，如人源凝血因子Ⅶ-EGF2蛋白(hFⅦ-EGF2)、人源凝血因子Ⅸ-EGF1蛋白(hFⅨ-EGF1)、人源凝血因子Ⅸ-EGF2蛋白(hFⅨ-EGF2)、人源凝血因子Ⅹ-EGF1蛋白(hFⅩ-EGF1)、人源凝血因子Ⅹ-EGF2蛋白(hFⅩ-EGF2)等等，迄今为止，尚未见以人源EGF结构域蛋白作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供人工制备的人源EGF结构域蛋白，本发明的另一目的是证明所述人源EGF结构域蛋白对革兰阴性菌具有抑制作用，人源EGF结构域蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。