[发明专利]一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法。

背景技术

Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase（M-MLV RT，M-MLV逆转录酶）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，基因来源是莫洛尼(氏)鼠白血病病毒基因组。它可以以单链RNA、DNA或RNA-DNA杂交体为模板进行cDNA合成。

M-MLV逆转录酶是从原核表达菌中（含M-MLV Reverse Transcriptase基因的BL21(DE₃)工程菌）进行提取纯化。

目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件下进行（冰上操作），常规纯化M-MLV逆转录酶方法采用低温超声破碎，反复通过硫酸铵沉淀、离子交换、层析和脱盐进行纯化，不仅高达50%的蛋白会在纯化初期就会损失，而且部分基因组蛋白很难完全去除，再加上基因组蛋白的存在会导致上柱速度缓慢，延长纯化时间，纯化得到的蛋白酶活降低，影响了后期酶的逆转录活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。

为实现上述目的，本发明提供一种提取纯化M-MLV逆转录酶的方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）工程菌的活化和表达：取M-MLV逆转录酶工程菌进行活化后并振荡培养后加入IPTG诱导；洗涤；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；

2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，吐温-20，冰上处理一段时间后离心，得到的上清即为粗蛋白；

3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀得到上清；

4）将所述得到的上清移至已经预热至60℃的水浴锅中，孵育后离心，去除沉淀，得到上清；

5）上清流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再进行脱盐得到纯化的M-MLV逆转录酶；

所述缓冲液A为20mM Tris-HCl，0.2M NaCl，pH 8.0； 

任选的，得到的M-MLV逆转录酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。

所述M-MLV逆转录酶工程菌为从莫洛尼氏鼠白血病病毒中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经SalⅠ、HindIII双酶切后连接至经SalⅠ、HindIII双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-M-MLV，将上述质粒转化表达菌BL21(DE₃)，即获得生产重组M-MLV逆转录酶的工程菌株。

所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

所述步骤1）为取M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌。

所述步骤1）为取M-MLV逆转录酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm，4℃离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌。

所述步骤2）为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟后加入DTT使终浓度为1mM，加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白。

所述步骤3）为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟，15000g，4℃离心20分钟，去除沉淀。

所述步骤4）中孵育10分钟，离心条件为15000g/4℃/20分钟。