[发明专利]一种提取纯化Taq DNA聚合酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取纯化Taq DNA聚合酶的方法。

背景技术

Taq DNA聚合酶为从Thermus aquaticus菌中分离出的大小约94kDa的一种热稳定性聚合酶。未经修饰的Taq酶能在74℃时复制DNA，在镁离子存在的情况下该酶催化核苷酸5′→3′的聚合反应成为双链DNA，同时也具有5′→3′的外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于PCR和较高温度条件下的引物延伸反应。高比活性的Taq DNA聚合酶特别适合应用于qPCR试剂盒的开发和一步法qRT-PCR试剂盒的开发。

目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件下进行（冰上操作），常规纯化Taq DNA聚合酶方法采用低温超声破碎，（70-75）℃水浴孵化，反复通过硫酸铵沉淀、离子交换、层析和脱盐进行纯化，不仅高达50%的蛋白会在纯化初期就会损失，部分基因组蛋白很难完全去除，再加上基因组蛋白的存在会导致上柱速度缓慢，延长纯化时间，纯化得到的蛋白酶活降低，影响了后期酶的聚合酶活性和外切酶活性，不利于qPCR试剂盒的开发应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。

为实现上述目的， 本发明提供一种提取纯化Taq DNA聚合酶的方法，其步骤为，

1）工程菌的活化和表达：取Taq DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；

2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，再加入吐温-20，冰上处理一段时间，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白；

3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；

4）上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡；所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，所述洗涤缓冲液为20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，50mM咪唑；最后用洗脱液洗脱目的蛋白，所述洗脱液为20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脱液；含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B： 10mM Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脱盐后即得到纯化的Taq DNA聚合酶；

任选的，得到的Taq DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。

所述Taq DNA聚合酶工程菌为从水生栖热菌yT1中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切后克隆入经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Taq DNA聚合酶的工程菌株。

所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

所述步骤1）为取Taq DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm,4℃离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；所述缓冲液A为20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。

所述步骤2）为将所述表达的工程菌用4mg/ml终浓度溶菌酶室温处理20分钟后加入DTT使终浓度为1mM，加入吐温-20使体积百分比为0.5%，冰上处理45分钟，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白。

所述步骤3）为粗蛋白中缓慢加入体积系数5%的二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌10分钟，15000g，4℃离心20分钟，去除沉淀。

所述步骤4）为上清液补足NaCl至终浓度为0.5M。