[发明专利]一种牡蛎活性肽的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属海洋天然产物与医药技术领域，涉及一种牡蛎活性肽的制备方法，以及在制备治疗化学环境干扰物双酚A暴露所致的卵巢功能紊乱的药物中应用。 

背景技术

海洋食品牡蛎具有巨大的食用价值和药用价值，是世界上第一大养殖贝类，在我国浙江省等沿海地区都进行大规模养殖。浙江宁海一带被誉为“牡蛎之乡”，已有700年的牡蛎养殖史。牡蛎的营养价值极高，牡蛎中的蛋白质含量高达45%-57%，其氨基酸组成完善。根据世界粮农组织评定，牡蛎肉中必需氨基酸完全程度和质量比例优于人乳和牛乳。古人将牡蛎称为“水产品之最贵者”，古罗马人把它誉为“海中美味-圣鱼”，西方人称之为“神赐魔石”、“海中牛奶”，日本人则誉之为“根之源”。 

牡蛎中丰富的生物活性肽、蛋白质、糖原、牛磺酸等生物活性成分为其在食品和医药领域的应用提供了巨大的支持。牡蛎是中国卫生部公布的第一批68种药食同源的食品之一。早在我国汉代《伤寒论》、明代《本草纲目》等医疗史籍中就已有关于牡蛎药用价值的记载。目前牡蛎产品的研发大多只关注牡蛎中牛磺酸的生理功能或牡蛎的全营养功能，而忽略其它成分的独特作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种牡蛎活性肽的制备方法，通过以下步骤实现： 

1. 新鲜牡蛎去壳、洗净，得新鲜牡蛎肉。在新鲜牡蛎肉中加入预冷的双蒸水，高速匀浆后放入4 ℃冰箱内静置l hr，以8000r/min，4 ℃离心30min，取上清液，冷藏备用。取上清液以HCL (1:1)调溶液pH至4，8000r/min离心10min，取上清液，以5mol/L NaOH调pH至9，再离心分离，上清液以HCL调至中性即为牡蛎粗蛋白。

2. 用蒸馏水准确配制5.0%的蛋白悬浊液，先将牡蛎蛋白悬浊液放置于4℃冰箱12小时，再用高速冷冻离心机4℃，7000-8000r/m，离心2次。收集上清液。采用高速分散器均质10min，放置于250 mL 的恒温酶反应器内预热至木瓜蛋白酶（Papain）的最适反应温度50℃。然后用0.5mol/L NaOH 调节至Papain的最适pH值8.5，继续搅拌20min，然后加入Papain启动反应，反应过程中连续搅拌，滴加0.2 mol/L NaOH 维持溶液pH值恒定，反应结束后，将反应物立即在95 ℃ 加热10 min灭酶，然后迅速用流水冷却，酶解物4 ℃、离心，收集上清液冷冻干燥，得到牡蛎Papain蛋白冻干粉。 

3. 取牡蛎蛋白冻干粉，用双蒸水配成20 mg/mL 的溶液，在磁力搅拌器上搅拌，用HCL 或NaOH调pH值至8.5，待pH 稳定后再连续搅拌浸提25 min，离心，上清液定容至50 mL。用生物传感器测定高温灭酶后的牡蛎酶解液中氨基酸的含量。通过Sephadex G-25层析柱对牡蛎酶解液进行分离，以超纯水为洗脱液洗脱，收集各洗脱峰，冻干后，凝胶柱脱盐得到牡蛎活性肽（CGE）。 

本发明的另一个目的是提供所述方法获得的牡蛎活性肽在制备治疗化学环境干扰物双酚A暴露所致的卵巢功能紊乱的药物中应用。 

本发明的有益之处是：（1）得到的牡蛎酶解液中总氨基酸的含量高；（2）有效保护了生物成分活性。申请人首次发现CGE可显著拮抗双酚A (BPA)所致的卵巢颗粒细胞功能干扰效应；同时发现CGE的这种拮抗作用是通过提高卵泡刺激素受体(FSHR)蛋白在颗粒细胞上的表达水平而实现的。 

附图说明

图1是不同温度下的酶解反应进程曲线。 

图2是血清中FSH，LH，E2的水平测定。 

图3是免疫组化法测定卵巢组织中FSHR的表达。 

图4是卵巢组织中FSHR的表达水平比较。 

具体实施方式

本发明通过附图和具体实施例作进一步的说明。 

实施例1 一种牡蛎活性肽的制备方法