[发明专利]水稻胞质型PPDK蛋白抗原表位、其抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体涉及一种水稻碳氮代谢相关的胞质型PPDK蛋白抗原表位、其抗体及应用。

背景技术

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase或pyruvate phosphate dikinase，PPDK；E.C.2.7.9.1)是C₄途径和景天科酸代谢(crassulacean acid metabolism，CAM)途径的限速酶，催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、丙酮酸和无机磷酸盐(inorganic phosphate，Pi)经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)，此反应具有可逆性。PPDK广泛存在于高等植物中，玉米、水稻、拟南芥、高粱、甘蔗、家稗和Flaveria属等植物的PPDK基因有很高的同源性。已有研究表明PPDK基因具有两个不同的转录起始位点，分别受两个启动子控制。其中，长转录物翻译为包含转运肽的C₄型PPDK蛋白，具有组织特异性及光诱导性，而短转录物翻译为不含有转运肽的胞质型PPDK蛋白。胞质型PPDK的表达量较低，可能对pH维持和柠檬酸循环中间产物补偿等非光合方面有重要作用。目前，对PPDK在C₃植物中的作用及非光合作用功能研究受到重视。

水稻至少有两个PPDK编码位点(PPDK1和PPDK2)，PPDK1基因定位在水稻第5染色体上，全长11kb，包含21个外显子和20个内含子；由两个功能独立的启动子，分别产生一个类C₄型PPDK-PPDKB(含有947个氨基酸残基，分子量为102.8kDa)以及一个胞质型PPDK-CPDK1(含有882个氨基酸残基，分子量为96.2kDa)。PPDK2基因定位在水稻第3染色体上，包含18个外显子，仅编码一个由887氨基酸残基组成、分子量为96.6kDa的胞质型PPDK——CPDK2。胞质型PPDK大量存在于发育的水稻籽粒中，其功能可能与籽粒发育早期的代谢相关，如自由氨基酸合成、脂肪酸从头合成以及脂类代谢等(Imaizumi等1997)。

迄今为止，关于水稻胞质型PPDK的研究还有待深入。蛋白质印记技术(Western Blot)利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中某目的蛋白，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。传统多克隆抗体制备过程多采用重组蛋白作为抗原，但重组蛋白的表达和纯化复杂且繁琐，在纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，即便是高纯度的重组蛋白，由于多个抗原决定簇的存在，所制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。为解决抗体特异性问题，多采用合成抗原表位的方法来制备抗体，即根据预测的抗原表位合成一段多肽作为抗原，多肽合成技术成熟，具有易操作、准确性高和成本低廉的优点。

发明内容

本发明通过对水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位进行预测并合成相应多肽作为抗原，制备了胞质型PPDK蛋白多克隆抗体，该抗体具有很高的灵敏性和特异性。具体地，本发明包括以下几方面：

本发明的第一个目的是提供一种水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位。通过分析水稻胞质型PPDK蛋白的特性(亲水性、表露性和柔韧性等)及二级结构，得到多个抗原表位序列，综合考虑多肽的长度等因素，确定了一条最有效的抗原表位，其多肽的氨基酸序列为EACQQYQAAGKT(SEQ ID NO:1所示)。

本发明的第二个目的是提供所述抗原表位的用途。该抗原表位用于制备人工合成多肽抗原以及水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体。

本发明的第三个目的提供是一种水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体的制备方法：首先对所述多肽的氨基酸序列进行末端修饰，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。

所述末端修饰为在氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基，修饰后的多肽的氨基酸序列为EACQQYQAAGKTC((SEQ ID NO:2所示)。