[发明专利]一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D‑塔格糖生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种基于酶促异构化反应和连续色谱分离原位耦合的D-塔格糖生产方法。

背景技术

塔格糖是一种六碳酮糖，分子式为C₆H₁₂O₆，是果糖的差向异构体，也是半乳糖的醛酮同分异构体。塔格糖分子量180g/mol，常态下为白色晶体，熔点和玻璃化温度分别为134 ℃和15 ℃，溶于水，微溶于乙醇，酸稳定性良好。D-塔格糖与木糖醇等甜味剂相比，具有口味更好、加工性更强、保健作用更多和安全性更高的特点，是一种优良的食品甜味剂。D-塔格糖2001年被美国食品药物管理局（US FDA）正式批准为普遍公认安全食品(GRAS)，2005年被欧盟批准在欧洲上市。D-塔格糖已在食品、饮料、护齿产品等领域获得了广泛的应用（Kruger et al., Regul. Toxicol. Pharmacol., 1999 29(2), pS29-35; Levin, J. Medc. Food, 2002 5(1), p23-26）。

D-塔格糖属于稀有糖类，很难直接从自然界中大量获取，只能通过人工手段制备。目前工业化的D-塔格糖生产主要采用化学法，在水溶液中将半乳糖转化成塔格糖，随后经分离步骤进行提纯（Beadle et al., US Patent, 5002612, 1991;Fabrice, WO Patent, 066192, 2005）。化学法的主要问题是使用碱金属盐或碱土金属盐催化剂，副产物众多，给后续的提纯过程造成困难，同时也会造成较为严重的环境污染。

D-塔格糖生产的发展趋势是使用生物法，途径主要有两种。一种是利用微生物所产生的脱氢酶将半乳糖醇氧化成塔格糖，Izumori等、Munimzzaman等和Manzoni等分别发现了不同的菌株可以将半乳糖醇氧化成塔格糖（App1. Environ. Microbiol, 1984 46: p1055-1057; ProcessBiochem., 2001, 36 p971-977; Ferment Bioeng., 1995 79 p620-622）。然而作为原料的半乳糖醇价格过高，这种方法的商业应用价值并不大。另一种途径则是利用异构酶将低廉的半乳糖异构成塔格糖。Cheetham等利用Lactobacillus gayonii 代谢产生的L-阿拉伯糖异构酶成功转化半乳糖生成塔格糖，首次提出利用乳酸菌生产塔格糖的设想（Enzyme Micro. Techno1., 1993 15 p105-108）。张华等人从泡菜中获得高产塔格糖的乳酸菌SKI．002（食品与发酵工业, 2006 32(6):5-7）。翁玮慧等从筛选的乳酸菌中得到L-阿拉伯糖异构酶（食品工业科技, 2006 (1):158-162）。目前，D-半乳糖异构生成D-塔格糖所需的L-阿拉伯糖异构酶已经得到了较为充分的研究和开发。

D-半乳糖异构化生成D-塔格糖为可逆反应，可以表述为：

其中A为反应物D-半乳糖，B为异构酶催化剂，C为产物D-塔格糖。转化率、产品溶液纯度和收率的定义为：

传统生物法由D-半乳糖制D-塔格糖采用以下工艺流程：

D-半乳糖——超滤——反渗透——微滤——水解——浓缩——发酵——异构化——浓缩——结晶——D-塔格糖成品

这一流程未能实现工业化的主要制约因素有两点：一是从工艺水平上看，D-半乳糖的转化率较低。以往技术主要从酶的菌株来源方面着手，试图提高转化率。然而，可逆反应转化率受化学平衡限制。理论上，任何催化剂（酶）都不能打破这一限制。因此，该方法的转化率往往被局限在40%左右。二是从生产方式上看，生物法采用传统的批次操作。随着可逆反应中产物的不断积累，酶的活性逐渐降低，逆反应影响越来越大，造成反应周期漫长（通常为2-3天）、生产效率低下的问题，同时也难以保证不同反应周期所得产品质量的均一性。

为提高D-半乳糖的转化率，中国发明专利200780045683.0通过添加硼酸盐与产物D-塔格糖结合，使化学平衡向右移动，将D-半乳糖转化率提高到70%的水平。然而该方法仍存在几个问题。一是硼酸盐有毒，不适合用于食品添加剂生产；二是添加硼酸盐后增加了下游分离纯化单元的负担；三是采用批次釜式反应器进行，反应周期仍在20小时以上，转化率无法进一步提高。