[发明专利]长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌种及其制备方法和应用，具体说是一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

长链二元酸是重要化工原料，具有极其广泛的用途，能够合成香料、特种尼龙、高级润滑油等一系列高附加值的化学品。长链二元酸可应用在军用领域、航空航天器的涂层、管路、汽车的表面涂层及油管等；在民用领域，可应用于汽车、日化香料、工程塑料、尼龙行业等十多个高新科技行业，可开发出更多的下游产业，形成新兴的产业链。

以往，长链二元酸采用化学合成法生产，其专利技术被国外所拥有。化学合成法生产长链二元酸，不仅产品种类单一，且合成工艺复杂、成本高、污染大。我国是世界上唯一能够采用微生物发酵技术实现多种长链二元酸大规模工业化生产的国家。此前，我国二元酸生产菌种的改良均是通过不同方式诱变等传统育方法实现的。传统育种方法具有很大随机性，筛选复杂。通过传统育种的方法已经很难进一步提高菌株的性能。当前长链二元酸工业化生产过程中仍有许多瓶颈问题，如底物转化率有待提高、生产能耗非常巨大等等。

代谢工程技术可以在基因水平上有针对性的进行菌种分子改造，获得性能更加优良的新菌株。如图1、图2所示，二元酸代谢途径主要包括ω-氧化途径和β-氧化途径，其中前者为二元酸合成途径，后者涉及二元酸降解途径。代谢工程的目的是通过分子改造手段来提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。国际上，Henkel公司(后来的Cognis公司)有专利报道(US005254466A)，用基因敲除方式来优化二元酸生产菌株，依次将4个POX基因敲除，达到完全阻断β-氧化，使底物转化率提高为100％。在此基础上，该公司进一步通过代谢工程手段共表达CYP单加氧酶和还原酶，以达到增强ω-氧化的目的，产量提高30％(World Patent WO/91/06660)。

但是利用该菌株进行批式发酵实验，其工艺仍无法与当时其他二元酸生产工艺竞争，而最终没有进行规模化生产。Henkel公司对菌种进行分子改造所使用的筛选标记为尿嘧啶营养缺陷型。Henkel公司发明专利的缺点为：1、出发菌株不是工业化生产所用的高产菌株；2、发酵法生产长链二元酸所用的假丝酵母为二倍体，即每个细胞具有两套染色体，每个基因都有对应的等位基因，而且催化每步体内生化反应的酶往往由多个基因编码。因此，通过代谢工程手段来增强或减弱某个体内生化反应的活性，需要对编码该酶的关键基因进行分子改造才有显著效果。否则，改造后效果也不会显著。

发明内容

本发明就是为了解决现有菌株生产长链二元酸效果不显著的技术问题，提供一种生产效率高的长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。

为此，本发明提供一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC027，所述菌株于2014年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：CGMCC No.8931。

本发明中，长链二元酸生产菌株过氧化氢酶等位基因CandidaA05093或CandidaA09561的启动子已被强启动子替换，过氧化氢酶等位基因的碱基序列分别如序列表中的序列8和序列9所示，过氧化氢酶基因为该菌株基因组中编码该酶的多个基因中对于长链二元酸生产最为关键一个。

本发明同时提供一种长链二元酸生产菌株的制备方法，其包括如下步骤：(1)准备引物Pro1、Pro2、Pro3和Pro-4；(2)准备长链二元酸生产菌感受态细胞，长链二元酸生产菌株为假丝酵母(Candida sp.)DC12；(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增分别得到筛选标记Sat1基因片段(引物Pro1和Pro2)和强启动子片段(引物Pro3和Pro4)，再经过一轮重叠PCR将两个片段连接起来，再将此重叠PCR扩增的产物通过同源重组替换过氧化氢酶等位基因的原始启动子，达到增强过氧化氢酶基因表达的目的，所述的过氧化氢酶等位基因的碱基序列如序列表中的序列8和序列9所示；(4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到本发明的长链二元酸生产菌株。

优选地，本发明中长链二元酸生产菌株的制备方法，筛选步骤中使用的筛选标记为clonNAT抗性。

优选地，长链二元酸生产菌株的制备方法，步骤(2)中的。

本发明同时提供长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。