[发明专利]基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器及其应用。

背景技术

单分子检测(SMD)是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。该方法被广泛应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及DNA和蛋白质的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，信号强度不再那么重要，每个可以产生信号的分子都可以被计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中。

为了实现SMD定量检测，单一分子的信号强度必须足够强以至于可以被检测到。目前常见的SMD定量检测方法之一就是，使用荧光标记物，如有机荧光染料和量子点(QDs)。Tan等课题组成功地利用染料标记分子信标来监测分子之间的反应动力学。但是，目前常用的荧光染料主要存在两方面的问题，一个是，相对低的荧光强度，另一个就是光不稳定性。为了解决上述问题，QDs作为一种全新的纳米标签已经被广泛应用于单分子检测之中。Jin课题组利用功能化的单个QDs实现了对蛋白质的定量检测。实验结果表明，QDs与传统的荧光染料相比，表现出出色的光稳定性和灵敏度。尽管QDs具有高的量子产率和出色的光稳定性的特性，然而，QDs自身的重金属毒性限制了其在蛋白质检测中的应用。为了克服上述问题，出现的另外一种保证单个分子信号强度的方法就是，利用寡核苷酸序列作为标记物。Echopf课题组设计了一种微球为基础的DNA检测策略，在该方法中，通过RCA引入大量的荧光探针，实现了对单个目标物分子的定量。然而，RCA为基础构建的放大技术需要蛋白酶的辅助。蛋白酶不仅对反应条件要求苛刻，而且增加了复杂性和成本，这些都限制了以蛋白酶辅助为基础的方法在实际检测中的应用。因此，迫切需要发展一种全新的、无酶的方法来构建SMD定量检测平台。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种重要的缩氨酸细胞因子，同时，也是癌症的生物标记物。TNF-α作为一种内源性的介质或是辅助因子，可以诱导某些肿瘤的出血性坏死。而且，许多的生理学和病理学过程都伴随TNF-α浓度的变化，例如HIV感染、系统性红斑狼疮、内毒素休克和风湿性关节炎等，因此，TNF-α的灵敏检测具有重要的实际意义。目前TNF-α的检测多采用酶联免疫吸附测定，但该方法存在重复性不好，灵敏度不高，检测限偏高等问题，并且易出现假阳性，影响检测的真实性。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器，将该免疫传感器用于TNF-α的检测，具有灵敏度高，重现性好等优点，并且具有高的选择性和低的基质效应。

本发明的另一目的是提供该免疫传感器在TNF-α检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器，由捕获抗体、检测抗体、链霉亲和素、生物素化的引物和发卡探针组成；

所述捕获抗体为肿瘤坏死因子-α捕获抗体(anti-TNF-α)；

所述检测抗体为生物素化的单克隆兔抗人肿瘤坏死因子-α(Bio-anti-TNF-α)；

所述生物素化的引物(Bio-I)的碱基序列为5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTT TTT TTT-biotin-3’,如SEQ ID NO.1所示；

所述发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中发卡探针H1的碱基序列为5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

发卡探针H2的碱基序列为5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-3’，如SEQ ID NO.3所示。

一种基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：