[发明专利]抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体，杂交瘤细胞株，及其应用。

背景技术

玻勒虹彩病毒(Bohle virus,BIV)属于虹彩病毒科蛙病毒属的确定成员。蛙病毒属以蛙病毒3型(FV3)为代表种，确定成员除了玻勒虹彩病毒(Bohle virus,BIV)外还有欧鮰病毒(European catfish virus,ECV)、欧鲇病毒(European sheatfish virus,ESV)和桑蒂库帕蛙病毒(Santee-Cooper ranavirus)等。蛙病毒的病毒颗粒较大(150～180nm)，呈二十面体立体对称。基因组为150～170kb的双链DNA，在胞核和胞质中均可进行复制。

该病毒的宿主范围很广泛，包括鱼类、两栖类、爬行类和一些易感染的其他动物种类。为了及时防止在水环境中玻勒虹彩病毒危害性的扩大，需要进一步了解其宿主的范围，这就要求尽快发展一种有效的检测技术。

目前，病毒分离和PCR方法是应用于玻勒虹彩病毒诊断的常用方法。但病毒分离法耗时较长，不易作为快速诊断；PCR方法，虽然用时较短，但是成本较高，不易作为大规模调查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体、应用该单克隆抗体的检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒，以及体外检测玻勒虹彩病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

本发明所提供的抗玻勒虹彩病毒的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.8555的杂交瘤细胞株分泌产生的。该小鼠杂交瘤细胞株已于2013年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.8555，分类命名为玻勒虹彩病毒的杂交瘤细胞株。

保藏编号为CGMCC No.8555的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种检测玻勒虹彩病毒的ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被本发明所述的单克隆抗体的固相载体。优选地，还包括羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体，和酶标抗羊的抗体。所述酶为辣根过氧化酶。

本发明采用商业化购买的酶标抗羊的抗体，是因为一方面，若标记本发明中表述的单克隆抗体或者是多克隆抗体，过程比较复杂。即使成功，都可能影响抗体的效价或者抗体的其他方面，使整个试剂盒研发更加繁琐，耗力，耗时。而应用商业化酶标抗羊的抗体，则不存在这个问题；另一方面，若标记本发明中的单克隆抗体或者是多克隆抗体，整个试剂盒的成本费用就很高，对于试剂盒推广应用是不可行的。应用商业化酶标抗羊的抗体(sigma)，每1ml费用是1000元左右，降低了试剂盒的成本。

进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为玻勒虹彩病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常组织匀浆液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。

本发明所述的羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体的制备过程如下：用玻勒虹彩病毒作为抗原，多点注射免疫山羊，分别是每1周免疫一次，共免疫4次，取血清，即为羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体。

本发明还提供了一种检测玻勒虹彩病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将待测样品加样于包被有权利要求1所述的单克隆抗体的固相载体；

(2)将羊抗玻勒虹彩病毒的多克隆抗体加样于步骤(1)获得的固相载体；

(3)将酶标抗羊的抗体加样于步骤(2)获得的固相载体；

(4)检测酶标记物，确定待测样品中玻勒虹彩病毒的存在与否或存在的量，从而确定玻勒虹彩病毒的存在与否。

本发明的有益效果如下：

1.分泌本发明所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株增殖后可制备大量所需的特异抗体。杂交瘤细胞注射小鼠后，产生的腹水单抗ELISA效价为1:1×10⁶。杂交瘤细胞株活性高，液氮中冻存8-10个月后，仍能快速复苏并保持良好活性。在所述的单克隆抗体的制备中，细胞融合率为97.6％，阳性率为98.0％。

2.免疫小鼠的抗原是根据免疫耐受的原理，以简单的差速离心方法粗提纯浓缩的病毒悬液作为免疫原，免疫小鼠。该免疫方法经多次实验数据已证实其主要优势是即保证了细胞融合后的阳性效果，又简化了抗原的制备方法。