[发明专利]抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别是一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物及其表达载体和应用。 

背景技术

Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成员之一，具有GTP酶活性。CDC42全称为细胞分裂周期蛋白42，其基因定位于1p36.1，是Rho家族中的代表成员，其在肿瘤发生发展中具有重要作用。国内外研究证实，细胞分裂周期蛋白42反义寡核苷酸可以在体外抑制胶质瘤细胞的增殖，但该技术也存在转染效率低，作用时间短的不足，使其抑瘤作用受到限制，另外，人工合成寡核苷酸的费用昂贵，也使该技术的应用遇到技术困难。 

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。miRNA 模拟物是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能近年来人工合成的miRNA（artificial miRNA，amiRNA）已经成功应用于沉默预期靶基因的表达及其功能研究，人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA 模拟物进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of-function）研究；相反，使用化学合成的方法合成miRNA inhibitors，特异的靶向和敲除单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性（loss-of-function）研究，可以用来筛选miRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成miRNA 模拟物和inhibitors是近年来研究的一个新热点，已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。 

从miRNA 模拟物的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势：miRNA 模拟物基因抑制效果确切，应用微量的模拟物即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上、甚至可以达到基因敲除的效果；其次, miRNA 模拟物 抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰； 同时，RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对细胞分裂周期蛋白42野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实：肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA的表达。 

发明内容

本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题，以RNA干扰机制为基础，通过人工合成或表达质粒序列转录形成的小双链miRNA模拟体可以靶向作用于细胞分裂周期蛋白42基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，达到使细胞分裂周期蛋白42基因表达降低的结果，而提供一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物及其表达载体和应用。  

本发明以RNA干扰技术为基础，从microrna数据库中中获得能够与细胞分裂周期蛋白42mRNA 3’UTR区域结合的miRNA，选择其中参考分值较高的miR-139-5P针对细胞分裂周期蛋白42基因设计了1条长度为19个核苷酸的miRNA 模拟物（见表1）（由上海吉玛公司合成）。通过一系列体外实验证实（实施例1），该模拟体对细胞分裂周期蛋白42的抑制效果最好。将miR-139-5p序列设计ShRNA正义链和反义链，以loop环相连，称为ShRNA。合成每条ShRNA的DNA模板的两条单链，两条单链DNA退火即为DNA双链模板（ShDNA Sense: