[发明专利]抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及抗蛇毒抗体技术领域，特别是指一种抗圆斑蝰蛇毒素和抗五步蛇毒素抗体及其制备方法和应用。

背景技术

圆斑蝰蛇(Vipera russellii)主要分布于我国广东、广西、福建、云南、湖南、江西、台湾等华南地区，是我国的主要毒蛇品种。圆斑蝰也广泛分布在东南亚，常见于马来西亚、越南、泰国、缅甸、柬埔寨等国。圆斑蝰属蝰科蝰亚科蝰属。

圆斑蝰蛇毒素主要是血液毒，毒性成分以凝血毒素为主，还含有较强的溶血毒素、纤维蛋白溶解毒素、抗凝毒素、血小板积聚变性因子、出血毒素、心脏毒素等。还含有许多酶类，主要有磷脂酶A₂，(PLA)、激肽释放酶、精氨酸酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、蛋白水解酶等。圆斑蝰蛇毒有很强的凝血毒素，可直接激活凝血因子X而发挥凝血作用；有类似凝血酶功能，能直接使纤维蛋白原变成纤维蛋白；激活凝血酶原作用。这几种凝血作用的共同结果是引起凝血纤溶症，这种纤溶症可以导致和加重弥漫性血管内凝血(DIC)、出血性休克、急性肾功能衰竭、内出血、脑水肿、急性心衰等。

圆斑蝰蛇的心脏毒素是由60个氨基酸组成的碱性多肽，分子量7KD左右，含4对二硫键，生化结构上和神经毒素相似。当心脏毒素被吸收进入血液循环达到一定浓度时，会对全身肌肉产生膜兴奋作用，心脏毒素的带有正电的碱性氨基酸与肌细胞膜外带负电部分产生静电吸引作用，使胞膜持久去极化而难以复极化。其结果是细胞膜的完整性破坏，细胞内的物质流出，细胞死亡。心脏毒素对心肌的损害最明显，中毒量大时可产生室颤，继而心脏停搏。心脏病理检查可见出血坏死灶、心肌纤维断裂等。圆斑蝰蛇的出血性毒素能促使炎症递质释放，造成血管内皮细胞联接的疏松，红细胞可以通过松散的细胞联接处漏出血管。出血毒素也可以引起毛细血管内皮细胞破坏，红细胞从破坏的内皮细胞处外渗出血。圆斑蝰蛇蛇毒中的卵磷酯酶A₂(PLA₂)可直接作用于红细胞膜上的磷脂，使红细胞破坏溶解。PLA₂可损害心肌，增强心脏毒素的毒性作用；破坏毛细血管管壁，增加通透性。PLA₂在低浓度时促进血小板凝聚，在高浓度时抑制血小板聚集，从而使血凝系统的调控失去功能。

圆斑蝰蛇毒素毒性很强，对人的致死量为42mg左右，同时圆斑蝰蛇的排毒量也很大，一次攻击可以排毒达到45毫克，足以造成伤者死亡。圆斑蝰蛇咬伤后患者发病迅速，症状严重，皮下出血形成瘀斑，血液大量快速凝固，血液中凝血因子消耗殆尽。随后，血液失去凝血功能，全身严重出血，常引起DIC。圆斑蝰蛇毒素还可以损害心肌，造成心肌功能障碍。

圆斑蝰蛇咬伤轻者可造成肢体残疾，重者死亡，圆斑蝰蛇咬伤的死亡率很高。对野外从事林业、农业生产的工作者危害极大。所以对研制相应特效治疗血清显得极为迫切。国外已有抗蝰蛇毒血清产品上市，主要针对分布于欧洲的蝰蛇种类制备，已生产使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清等。英国药典1993年版第二卷记载的河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清的效价分别为:抗河蝰(Vipera ammodytes Venom)抗血清不低于100LD₅₀，抗毒蝰(Vipera aspis Venom)不低于100LD₅₀，抗北极蝰(Vipera berus Venom)不低于50LD₅₀，抗草原蝰(Vipera ursinsi Venom)不低于150LD₅₀。

五步蛇(学名：尖吻蝮，地方名：白花蛇、蔪蛇、百步蛇等)属蝰蛇科蝮亚科，尖吻蝮属。五步蛇头大，明显三角形，吻端尖而向上翘。头背黑褐色，头侧自吻鳞经眼至口角上唇鳞以上均为黑褐色，以下黄白色，偶有少许黑褐色斑点。头腹及喉部为白色，散有少数黑褐色斑点。最大体长可达1.5m。五步蛇已知的分布地区有安徽、重庆、江西、浙江、福建、湖南、湖北、广西、贵州、广东及台湾省。国外只见于越南北部。

五步蛇生活在海拔100～1400m的山区或丘陵地带。大多栖息在山谷溪涧附近，偶尔也进入山区村宅。喜食鼠类、鸟类、蛙类、蟾蜍和蜥蜴。之所以称之为五步蛇，意指人类只要曾被其所咬，脚下踏出五步内必然会毒发倒地，以显示该蛇奇毒无比。该蛇种的毒液的单位上的毒性(对小白鼠之LD₅₀值)并不强烈，但是排毒量大，具有较大的危险性由五步蛇的咬击所导致的死亡事件是较为常见的(赵尔宓、黄美华等主编《中国动物志爬行纲第三卷》科学出版社1998年版390页)。