[发明专利]一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法，特别是适用于难转染的CEMx174细胞系。

背景技术

转染是将外源核酸导入真核细胞中并发挥其生物学作用的一种技术，导入的核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA)，反义寡核苷酸及RNAi(RNA interference)。目前，基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。

转染技术根据时效可分为瞬时转染和稳定转染两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，可导入多个拷贝，获得目的基因暂时的高水平表达，适用于在转染后1～4天内收获细胞，检测目的基因表达结果的实验。稳定转染是用于建立单克隆的细胞系，使得目的基因整合到靶细胞染色体中或者以游离形态稳定存在于持续传代培养的细胞中，指导目的基因的适量表达。一般来说，稳定转染的表达效率比瞬时转染低1～2个数量级，但是效果更持续稳定，重复性好。通常利用可选择的遗传标记物用药物筛选出转染成功的细胞，建立单克隆细胞系，如G418(新霉素抗性)，氨喋呤(胸苷激酶抗性)，嘌呤霉素(嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶抗性)。

现今常用的转染方法可归为三类：生化方法，病毒介导的方法以及物理方法。

生化方法是实验室中最为常用的一种，是通过转染试剂与核酸形成复合物后易化核酸接近贴壁的细胞并促进细胞的内吞作用使核酸进入细胞内，常用DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，脂质体法等。但是由于细胞膜结构的差异，或是悬浮团簇状生长的方式降低了复合物与细胞接触的几率，这类转染方法对于悬浮细胞效果甚不理想。虽然有很多号称可以转染悬浮细胞的新型改良试剂，但其结果依然差强人意。

病毒介导的转染通常是用逆转录病毒载体。它属于RNA病毒，可在靶细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，从胞内释放，成为感染性病毒，其介导的过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。理论上，这种逆转录病毒载体介导的转染方法可以获得较高的转染效率，但是其前期的准备工作繁琐复杂，且存在一定的安全风险，不适合广泛的应用。而且，根据本室的实践研究，该方法转染悬浮细胞的结果也并不理想。

而常用的物理方法有两种：通过直接显微注射将细胞膜穿孔并导入核酸，或利用短暂的电流脉冲在质膜上瞬时形成可让核酸通过的微孔并使核酸在电场作用下主动进入细胞。前者主要用于转基因动物的制备，不适于大量细胞的转染。而电穿孔技术的应用范围则更广泛，可以快速、简便、有效的将DNA导入包括细菌、酵母、植物细胞与多种培养的哺乳动物细胞中。

CEMx174细胞系是人T、B淋巴母细胞杂交株，由721.174(LCL721B淋巴母细胞系变种)和CEMR.3(CEM T淋巴母细胞系的氮鸟嘌呤和乌巴音抵抗克隆株)杂交得来(Salter RD，Howell DN，1985)。该细胞株表达CXCR4(Strizki JM et a1，1997)，CCR5(Miyagi T et al，2000)，孤儿受体GPR15(Kiene M et al，2012)等，是重要的SIV及HIV感染的细胞模型，广泛用于病毒感染的机制以及临床药物作用的研究(Dong MX et al，2012；Lim HG et al，2008；Newman JT et al，2007)。同时，CEMx174细胞系也表达阿片受体(μ/κ/Δ)，因此经常用于吗啡等阿片类药物的作用机理研究及临床应用研究(Miyagi T et al，2000；Jin Xu et al，2004；Han Liu et al，2009)。然而，CEMx174细胞系与其他的淋巴细胞系(如Jurkat、U937等)具有相同的生长特性，呈悬浮团簇状生长在培养液中，同样，转染效率非常低，经常严重的阻碍实验研究的进行。常用的脂质体转染试剂或阳离子转染试剂都不能达到让人满意的效果，转染效率低而且重复性差，直接干扰了后续实验的进行，对实验结果的可信度和可靠性造成干扰。