[发明专利]一种不整合可删除新型非病毒载体及其构建方法和用途

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物领域的一种非病毒载体，具体地说，涉及一种不整合可删除非病毒载体及其构建方法和用途。

【背景技术】

如今，转基因技术不单单用于科学研究，还已经广泛应用于社会生产生活中。在诱导多功能干细胞技术及转分化技术发明以后，转基因技术大量应用于临床已是必然趋势。现在转基因技术用于临床的其中一个障碍就是安全性：首先，外源基因随机插入到基因组上，存在造成基因突变、基因沉默等潜在风险；其次，外源目的基因无法及时清除，特别是当目的基因具有成瘤作用时，这是非常危险的；最后，有的载体需要表达病毒蛋白，一些病毒蛋白本身具有致癌作用，并且有较高的免疫原性，在临床应用中受到很大限制。

转基因技术出现以后，研究者对转基因载体的安全性的提高一直做着不懈的努力。首先是一类以SV40、BPV、EBV病毒为基础的载体的出现。这类载体实现了在真核细胞中以游离基因的形式进行复制遗传，从而解决了载体基因在宿主细胞基因组中随机插入的难题。但是这类载体的复制都需要表达病毒来源的反式作用因子，而这类蛋白会转变宿主细胞，例如：基于SV40病毒的载体复制，需要表达大T抗原（其他蛋白由宿主细胞提供），而大T抗原能永生化原代细胞，在应用于动物时，就会导致肿瘤的发生。

1999年，H.J.Lipps实验室发现将人类来源的S/MAR元件替代了SV40大T抗原基因，而保留SV40的复制原点（origin），构建的载体pEPI-1仍然可以在CHO细胞中以游离基因的形式复制遗传，并且在没有抗性筛选的情况下，可以在CHO细胞中保留100代以上。S/MAR序列来源于人类β干扰素基因5’端支架粘连区，这类区域是典型的A/T富集序列，在维持染色体结构中起重要作用。pEPI-1经过了多次改善，都集中在精简序列和减少CpG原件上，从而提高载体的转染效率以及表达效率，如pEPito。后来H.J.Lipps实验室和Anthony Atala分别在动物实验以及人类诱导多功能干细胞中，验证了基于S/MAR-SV40-Origin系列载体的可行性。

作为不整合的非病毒载体，S/MAR-SV40-Origin载体已经提高了很大的安全性，但是仍然存在着隐患。在诱导体细胞重编程过程中为了提高表达效率和转化效率，常常会使用强启动子，而应用于临床需要重编程细胞再次分化，这时持续的表达分化早期的外源基因是我们不想看到的。

综上所述，还亟需构建一种更安全的转染载体，以促进诱导多功能干细胞技术和转分化技术早日应用于临床治疗。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种不整合可删除新型非病毒载体。

本发明的再一的目的是，提供一种如上所述的非病毒载体的构建方法。

本发明的另一的目的是，提供如上所述的非病毒载体的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种不整合非病毒载体，所述的非病毒载体包含S/MAR序列、SV40复制原点和Cre-ERT2表达序列，所述的S/MAR序列的上游和下游分别具有一个loxP序列，两个loxP方向相同，且其中一个loxP序列位于S/MAR序列和SV40复制原点之间。

所述的非病毒载体还包括外源目的基因，优选的为EGFP。

所述的S/MAR序列、Cre-ERT2表达序列和外源目的基因共用启动子和终止子，所述的启动子优选为真核表达的启动子。

所述的Cre-ERT2表达序列与外源目的基因用IRES序列连接。

一个LoxP序列在所述启动子上游连接，另一loxP序列在S/MAR序列的下游连接。

所述的S/MAR序列如SEQ ID NO.6所示，所述的SV40复制原点的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的Cre-ERT2表达序列如SEQ ID NO.2所示，所述的loxP序列与SEQ ID NO.8有85%-100%相似度，优选的LoxP序列如SEQ ID NO.8所示。

所述的非病毒载体是通过以下方法构建的：

a）从序列如SEQ ID NO.1所示的pEP4-Cre-EGFP质粒中克隆出Cre-ERT2-IRES-EGFP片段，

b）将Cre-ERT2-IRES-EGFP片段插入pcDNA3.1(-)质粒的CMV Promoter下游，得到pcDNA-Cre-EGFP质粒，

c）用EF1α Promoter替换pcDNA-Cre-EGFP中的CMV Promoter得到pECG质粒，