[发明专利]一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及疫苗学技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

嗜水气单胞菌属于弧菌科，气单胞菌属，是多种水生动物的原发性致病菌，具有高粘附力的嗜水气单胞菌株可产生毒性很强的外毒素。嗜水气单胞菌侵入水生动物后，在肠道内增殖，再进入肝脏、肾脏及其它组织，引起这些器官及血液病变，导致水生动物中爆发败血症等严重流行性疾病。

目前对其防治，仍主要依赖传统药物。在养殖鱼类中新型抗嗜水气单胞菌病疫苗的开发是近些年的研究热点，但主要集中于全菌灭活疫苗和减毒活疫苗。上述两种疫苗制备方法简便，但是灭活疫苗在水产养殖动物中的使用需要大剂量、多次免疫接种，而减毒活疫苗的储藏和运输条件极高，有效期较短，且存在返毒风险，因此它们均可能引起较大的毒副反应。养殖龟鳖相关病害的疫苗开发远落后于鱼类，市场上并无实际可用的易长期保存、高效疫苗来防治中华鳖弧菌病害。在动物饲料中添加一些可诱发自身免疫的天然化合物以增强水产养殖动物自身免疫能力是预防相关致病菌感染的一条切实可行的途径。亚单位疫苗即由具免疫活性的致病菌蛋白所制成的疫苗。亚单位疫苗通常仅含一种或者几种致病菌蛋白质，因而能消除许多无关抗原所诱发的抗体，减少疫苗带来的副反应以及因疫苗引起的其它疾病，开发新型高效的亚单位疫苗是预防致病菌感染的发展趋势之一。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗及其制备方法的技术方案。

所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗，其特征在于该疫苗抗原含有SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列。

所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的疫苗为含有SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列的重组质粒pETDnaK转化大肠杆菌BL21(DE3)中获得的重组蛋白。

所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）热激蛋白基因的克隆：以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板，使用AH DnaK F1和AH DnaK R1为引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化后与载体pEASY-Simple-T1室温连接10分钟，将混合液转化至大肠杆菌DH5α中，在含有100μg /ml氨苄青霉素、40μg/ml X-Gal和24μg/ml异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固体培养基上培养16小时后筛选阳性克隆，获得重组质粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK F1序列如SEQ ID No.2所示，所述的引物AH DnaK R1序列如SEQ ID No.3所示；

2）质粒pETDnaK的构建：使用快速限制性内切酶SmaⅠ酶切质粒pEASYDnaK，37℃水浴中孵育5分钟后加入去磷酸化酶继续孵育15分钟后，使用1%琼脂糖凝胶电泳回收热激蛋白DnaK基因片段，将其插入pET259质粒SwaⅠ多克隆位点处，转化至大肠杆菌DH5α中，使用含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基后37℃筛选阳性克隆，获得重组质粒pETDnaK；

3）质粒pETDnaK的诱导表达：将步骤2）所得质粒pETDnaK转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，使用含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基37℃筛选阳性克隆，获得转化子BL21/ pETDnaK，将BL21/ pETDnaK于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜培养；而后转接至新鲜LB培养液中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养4个小时后，收集菌体，并裂解离心收集上清，采用his亲和层析柱纯化重组蛋白，即可获得具有序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的亚单位疫苗重组蛋白AH DnaK。

所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中PCR条件为：94℃ 5min预变性模板DNA,然后94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，5个循环后调整为94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 1min，25个循环后72℃延伸10min。

所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗在制备预防和治疗中华鳖对嗜水气单胞菌的侵染疫苗制剂中的应用。

本发明具有如下优点：

1、安全无毒。避免发生弱毒疫苗的返祖现象，以及使用灭活疫苗大量多次免疫可能对水体造成的污染。

2、高保护率。本发明的重组亚单位疫苗AH DnaK对嗜水气单胞菌的免疫保护效率可达81.8%。