[发明专利]用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的设计与合成

说明书

技术领域

    本发明属于蛋白质顺磁标记领域，涉及用于蛋白质顺磁标记的DTPA类似物的合成与应用。

背景技术

蛋白质的分子结构是其生物功能的基础，高场液相核磁共振技术（NMR）作为解析具有原子分辨率的蛋白质结构的两大主要手段之一，在近二十多年得到了迅速的发展。另一种主要手段是X-射线晶体衍射，到目前为止，X-射线晶体衍射技术是直观说明生物大分子空间结构信息的最主要技术手段，它为分子生物学的发展做出了非常杰出的贡献。但是这一技术其自身也有一定的局限性：（1）要求样品必须是晶体，但并不是所有的样品都容易结晶，并且晶体状态在生理条件下（pH，盐浓度，温度等）不易得到；（2）蛋白质样品在溶液中的结构其实是一个不断变化的过程，而一旦结晶仅仅是蛋白质的其中一个形态，并不能真实的反映出蛋白质在溶液中的具体形态；（3）虽然X-射线晶体衍射仪测出的温度因子可以反映生物大分子的柔性，但是不能反映出其动态变化的快慢。

随着核磁谱仪硬件技术的不断发展，以及脉冲技术、新的蛋白质标记技术的发现，高场液相核磁共振技术能够研究的蛋白质不断突破分子量的限制，可以达到几万，甚至几十万（波谱学杂志. 2009, 26, 151–172）。多维核磁共振在确定生物大分子的空间构象方面具有独特的优点：（1）：不需要结晶，在更加接近生理条件下研究生物大分子在溶液中的空间结构和功能之间的关系；（2）：可以不用破坏生物大分子的结构，在自然状态下对样品进行研究；（3）：可以研究生物大分子的动态行为（生物大分子多维核磁共振. 中国科学技术大学出版社. 第一版. 1999）。

利用核磁共振研究蛋白质溶液结构及功能的传统方法是奥沃豪斯效应（Nuclear Overhauser Effect，NOE）和二面角等限制性约束条件。当原子间的空间距离足够近时（6 ?），使用特定的NMR脉冲序列能够观测到这些原子间基于偶极耦合作用的相关信号（NOEs）。NOE信号的强度与原子间距离的6次方成反比，基于此可以将观测到的NOE信号转化为空间距离约束条件来测定蛋白质的空间结构。当研究大分子量蛋白质时，由于蛋白质分子具有较强的自旋-自旋弛豫效应而很难归属氨基酸残基的侧链质子，从而不能获得足够多的 NOE 结构限制条件。另外研究蛋白质复合物的结构时，接触面的质子信号由于线宽变宽导致很难观测到足够的 NOE 作为结构约束条件。二面角提供原子间相对取向，只能提供短程的结构信息，不易得到蛋白质内部结构域之间的相对取向。

与传统的核磁共振相比，顺磁核磁共振能够提供长程的结构限制信息，在解决大分子量蛋白质的溶液结构，蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用等方面具有明显的优势。

物质中具有不成对电子的分子、原子或离子时，存在电子的自旋角动量和轨道角动量，也就存在自旋磁矩和轨道磁矩，在外加磁场的作用下，原来取向杂乱的磁矩将定向，从而表现出顺磁性。顺磁性是一种物质的磁性状态，与顺磁性相反的现象是逆磁性或称抗磁性。具有顺磁性的物质在外磁场条件下产生的磁矩与处在同一磁场中的自旋核相互作用，从而使该自旋核的弛豫时间、化学位移、谱峰宽度等发生变化，这种效应称为顺磁效应。

用顺磁标签位点专一的标记蛋白质和寡核苷酸可以在生物大分子中产生明显的顺磁效应，主要有三种效应可以提供长程的结构信息：（1）顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement，PRE）；（2）贋接触化学位移（pseudocontact shifts，PCS）；（3）残余偶极耦合（residual dipolar couplings，RDC)。

化学合成的镧系结合标签通过与蛋白质上唯一的活性氨基酸残基（例如半胱氨酸，人工合成的氨基酸）反应，可以对蛋白质进行定点标记。甲基硫代磺酸盐和二巯基吡啶是常用于活化巯基的试剂，用它们活化的标签可以与蛋白质中半胱氨酸的巯基发生二硫键交换反应，生成新的二硫键。镧系金属离子的配位数可以达到8、9，所以含有多氨基多羧基的配体是常用的螯合剂。乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）、三氨基六乙酸（TAHA）、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N′,N′-四乙酸（PyMTA）这些化合物都可以和镧系金属离子形成热力学稳定的络合物，许多化学合成的镧系结合标签是以上述螯合物为骨架，然后接上可以和蛋白质反应的活性基团。