[发明专利]一种高纯度棘白霉素B母核的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高纯度棘白霉素B母核的制备方法。

背景技术

近年来，由于器官移植手术导致免疫抑制剂的大量使用，化疗和更具侵袭性的医疗方法的应用等多种原因造成免疫低下患者增多，真菌感染发病率显著升高，尤其是深部真菌感染的发病率和病死率逐年增加，因此新型抗真菌药物成为了研究热点。棘白霉素类抗真菌药物是以真菌细胞壁为作用靶点，非竞争性的抑制细胞壁β (1,3)-D-葡聚糖合成，使细胞周期停滞，细胞壁完全性破坏，导致细胞溶解死亡。而哺乳动物无细胞壁，缺乏该合成酶，故棘白霉素类药物对真菌细胞有较高的特异性，对人体正常细胞影响较小。

棘白霉素B（Echinocandin B）在脱酰基酶作用下，将酰基侧链切掉，生成棘白霉素B母核（Echinocandin B Nucleus,简称ECB Nucleus），再接上活性酯侧链生成阿尼芬净，该药2006年在美国上市，市场潜力巨大。

棘白霉素B母核为浅黄色粉末，在水、二甲基亚砜中易溶，在甲醇、乙醇中微溶，在氯仿中极微溶，在丙酮中不溶。棘白霉素B母核结构复杂，很难化学合成，目前主要依靠微生物发酵转化获得。

有关棘白霉素B母核分离纯化的报道比较少。文献（Boeck LD, Fukuda DS, Abbott BJ. Deacylation of echinocandin B by Actinoplanes utahensis[J]. J Antibiot, 1989, 42(3): 382-388.）介绍的分离提取工艺：棘白霉素B母核的转化液使用HP-20树脂吸附分离，后使用制备色谱分离出高纯度的棘白霉素B母核，该法制备纯度较高，但处理量小，无法实现工业化生产。

国内的专利文献中也公开了一些棘白霉素B母核的分离纯化方法。专利文献CN102336817，将棘白霉素B母核的转化液，先使用非极性大孔吸附树脂粗分离，再使用大孔丙烯酸树脂二次分离得到纯度较高的棘白霉素B母核。该法虽然适合较大规模生产，但提取过程中使用了大量的溶媒，不仅增加了生产成本，还易污染环境。

因此如何从发酵转化液中制备出高纯度棘白霉素B母核，而且成本低，环境友好，适合大规模化工业生产，成为了研究的难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度、低成本、环保无污染、适于工业化生产的棘白霉素B母核的新工艺。制备得到的棘白霉素B母核产品，含量大于96%，总收率大于70%。

下面对本发明进行具体描述：

本发明的方法包括如下步骤：首先向棘白霉素B母核的转化液中加入酸调至酸性，加入聚丙烯酰胺絮凝剂沉淀杂蛋白，加入助滤剂，搅拌均匀，过滤后得到初滤液，初滤液调至近中性后再次过滤去除杂质，得终滤液，终滤液上脱色树脂柱，脱色液上大孔吸附树脂柱，酸溶液解析，解析液浓缩后调节pH值，上聚苯乙烯或二乙烯基苯类层析树脂柱，含乙醇的酸水溶液洗脱，洗脱液冻干得到高纯度棘白霉素B母核精粉。

    具体地，本发明涉及一种高纯度棘白霉素B母核的制备方法，包括以下步骤：

    1）棘白霉素B母核的转化液用酸调节pH值为4.0-4.5，加入聚丙烯酰胺絮凝剂沉淀杂质，加入助滤剂搅拌分散均匀，固液分离，得到棘白霉素B母核初滤液；

2）棘白霉素B母核初滤液用碱溶液调节pH值为6.0-6.5，加入助滤剂搅拌分散均匀，固液分离，得到棘白霉素B母核终滤液；

3）将棘白霉素B母核终滤液通过大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；

4）将脱色液导入大孔吸附树脂吸附，吸附完毕，使用酸水溶液进行解析，HPLC检测，收集解析液，浓缩，得到浓缩液；

5）将浓缩液调节pH值为6.0-6.5，上聚苯乙烯或二乙烯基苯类层析树脂柱，用含乙醇的酸水溶液进行解析，HPLC检测，收集层析液，冻干制得棘白霉素B母核精粉。

其中步骤1）中调节pH值所用的酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸或冰乙酸中的任意一种，优选为冰乙酸，转化液调酸，一方面有利于转化液过滤，另一方面有利于絮凝沉淀杂质，加入的聚丙烯酰胺絮凝剂分子量为2000-15000 KDa，终浓度为50 ppm。

步骤1）或2）中所用助滤剂为珍珠岩或硅藻土，优选为珍珠岩，用量为每升转化液中加入助滤剂0.03-0.05千克。