[发明专利]模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用

说明书

技术领域

本专利涉及生物技术领域，具体涉及模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用。

背景技术

桔青霉素(Citrinin，CIT)，又称为桔霉素，是青霉属和曲霉属等真菌菌株产生的真菌毒素，广泛存在于多种食品及动物饲料中。CIT污染也存在于传统红曲发酵产品，广泛用于食品着色及风味增强。同时因其发酵代谢产物有多种功能活性成分也用于保健食品中。毒理学研究表明CIT具有肾毒性、肝毒性和潜在的致畸性，且能引发肿瘤和诱发突变。严重危害人体和动物的健康。因此，对食品中CIT含量的检测监控十分必要。

目前，常见的真菌毒素检测方法有高效液相色谱法、液质联用分析法、免疫分析法。高效液相色谱法等仪器分析法具有检测准确、重复性好等特点，但同时也有仪器价格昂贵、样品前处理过程繁琐、样本检测耗时长、不能同时检测多个样品等缺点，因而其使用受到极大的限制，不适于基层监控使用。酶联免疫吸附检测法以其高灵敏度、检测方便、成本低廉等优势广泛用于真菌毒素的初步检测。然而，在方法建立过程中，必须使用真菌毒素标准品作为竞争抗原和制备包被抗原，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁。因此，采用抗独特型抗体及抗原模拟表位等技术可替代有害的毒素标准品，并已取得了一定的进展。噬菌体展示技术已广泛用于从天然抗体库或免疫抗体库中淘选得到特异抗体。该技术在研究未知蛋白空间结构表位，受体与配体结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子及新型疫苗的开发等方面也得到广泛应用。

发明内容

本发明通过对天然纳米抗体噬菌体展示库中，筛选得到能与抗桔青霉素单克隆抗体特异结合的纳米抗体，该抗体具有与天然CIT分子相似的反应特性，能替代毒性较强的CIT标准品，并可作为竞争抗原或固相包被抗原应用于CIT的免疫学检测。

本发明以抗CIT单克隆抗体为靶分子，将其固相包被于酶标板上，加入噬菌体展示的天然驼源单域重链纳米抗体库，进行亲和淘选，获得了可以模拟桔青霉素抗原的纳米抗体。

本发明模拟桔青霉素抗原的纳米抗体：

（a）该抗体的氨基酸序列如下：

QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS

上述纳米抗体的序列中，大写英文字母分别代表二十一种已知的天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，C代表半胱氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，E代表谷氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，G代表甘氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，K代表赖氨酸残基，L代表亮氨酸残基，M代表蛋氨酸残基，N代表天冬酰胺酸残基，P代表脯氨酸残基，Q代表谷胺酰氨酸残基，R代表精氨酸残基，S代表丝氨酸残基，T代表苏氨酸残基，V代表缬氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。

（b）将（a）中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对抗桔青霉素单克隆抗体结合活性的由（a）衍生的与（a）具有90%以上同源性的氨基酸序列。

本发明还涉及所述模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的核苷酸。

以及，包含所述核苷酸序列的载体，包含所述的载体的宿主细胞。

本发明提及的模拟桔青霉素抗原的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该抗体的基因，通过克隆至表达载体上，以蛋白的形式大量制备。

本发明还涉及所述的该纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测方法。

本发明模拟桔青霉素抗原的纳米抗体在应用时，可通过噬菌体扩增获得的展示有该纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，也可以通过基因工程表达成蛋白作为包被抗原用于分析检测。当然，也可作为CIT标准品的代替物来进行免疫学检测分析。

还涉及该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

前述该纳米抗体可替代具有较强毒性CIT标准品，并作为固相包被抗原或竞争抗原应用于CIT的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然CIT分子相似的免疫反应特性，效果非常好。