[发明专利]一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用

权利要求书

1.一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13，其特征在于：该酶具有芳基酰基酰胺酶活性，芳基酰基酰胺酶活性的最适作用pH值为8.0，最适作用温度为35-45℃。

3.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13，其特征在于：该酶的芳基酰基酰胺酶活性测定方法为：在20mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl缓冲液中加入反应底物和酰胺酶Azl13，于35℃反应；再通过液相色谱检测酰胺酶Azl13催化效率。

4.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求4所述的编码基因连接到原核表达载体中构建重组表达质粒；并将所形成的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13。

6.根据权利要求5所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）重组His-Azl13质粒的构建

提取链霉菌211726的总DNA，利用特异性引物azl13-F和azl13-R对链霉菌211726的总DNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后与原核表达载体pET28a(+)分别用NdeI和EcoRI酶切，回收酶切片段，将这二片段用T4 DNA连接酶连接；将连接产物导入大肠杆菌DH10B，筛选转化子提取质粒，得到重组His-Azl13质粒；

其中，特异性引物azl13-F和azl13-R如下：

azl13-F：5’-GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’，

azl13-R：5’-GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3’；

（2）Azl13的表达与制备

提取大肠杆菌DH10B中的重组质粒His-Azl13，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选转化菌株接种至含卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜；第二天接种种子液至1L含卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养培养至OD₆₀₀=0.6加入IPTG 16℃诱导20h；诱导后培养物经超声破碎和镍柱纯化后得到目标蛋白酰胺酶Azl13。

7.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13在环境污染物的治理中的应用，其特征在于：所述的环境污染物为苯胺酰胺类化合物。

8.根据权利要求7所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13在环境污染物的治理中的应用，其特征在于：所述的环境污染物为敌稗。