[发明专利]一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。 

背景技术

糖胺聚糖（Proteoglycans，GAG）又称为粘多糖，是重复二糖单位组成的直链多糖。主要包括透明质酸（Hyaluronic Acid，HA），肝素/硫酸乙酰肝素（Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS），硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS），硫酸角质素（Keratan Sulfate，KS）。除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成以外，其它糖胺聚糖的二糖单位均是由己糖醛酸（D-葡萄糖醛酸/L-艾杜糖醛酸）与己糖胺（N-乙酰氨葡萄糖胺/N-乙酰半乳糖胺）组成。其中透明质酸结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成。其它糖胺聚糖则由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现在糖链中不同部位羟基（-OH）和氨基（-NH2）的硫酸化，D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖糖链结构的这种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。 

糖胺聚糖广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中，通过与各种蛋白的特异相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程(Knudson and Knudson1993,Perrimon and Bernfield2000,Karbownik and Nowak2013)糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如肝素、硫酸软骨素、透明质酸(Noble2002,Jiang,Liang et al.2007)等。但由于糖胺聚糖结构的不均一性，特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复杂性，使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异(Sugahara,Mikami et al.2003)。近年来的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的，同一多糖链中存在不同结构的功能区，与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能，因此可以通过选择性部分降解糖胺聚糖多糖链，制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖用于医药及功能食品，该类产品不但结构和活性确定，而且还由于分子量小利于吸收而大大提高了利用率。 

糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖构效关系的重要工具酶，主要包括微生物来源的裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物的不同可分为透明质酸酶、硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解酶、肝素/硫酸乙酰肝素降解酶、硫酸角质素降解酶四大类，其中大部分透明质酸酶可以同时降解非硫酸化及N-乙酰半乳糖胺4位（CS-A）或6（CS-C）位羟基硫酸化的低硫酸化度硫酸软骨素区段，但降解速度远低于降解透明质酸。如来自绵羊和牛睾丸的透明质酸水解酶(Zaneveld,Polakoski et al.1973)，可以在酸性PH下将透明质酸完全降解为四糖和六糖。而来自链霉菌的透明质酸裂解酶则只能降解透明质酸，终产物是非还原端带不饱和双键的四糖和六糖(Ohya and Kaneko1970)。在动物体内一直未发现专一的硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解 酶家族，越来越多的研究显示哺乳动物体内硫酸软骨素/硫酸皮素的降解主要是由透明质酸酶家族的一些酶来完成的，最近透明质酸酶家族成员HYAL4被鉴定为一个硫酸软骨素水解酶(Yamada,Sugahara et al.2011)。微生物来源的硫酸软骨素裂解酶（CSase），如CSase ABC和CSaseAC都表现出一定的透明质酸降解活性，但CSase B是高度专一性硫酸皮肤素降解酶，对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。利用各种糖胺聚糖降解酶所具有的不同底物选择性和产物多样性，可以对结构复杂的糖胺聚糖进行组成结构和功能研究，结合各种分离分析手段对多糖链中与靶蛋白结合的特定功能区进行鉴定，并最终用于高活性药用及功能寡糖的酶法制备。