[发明专利]一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法。

背景技术

人们对枯草芽孢杆菌生防潜能的研究已经有很多年了，田间应用研究已经证实枯草芽孢杆菌菌剂在产品中的稳定性枯草芽孢杆菌是生物防治中报道较多的一种拮抗细菌，在植物病害的生物防治中发挥尤为重要的作用。在土地中代谢产生光谱抗菌性物质，形成优势菌群，有抗逆能力和抗菌防毒作用，目前有很多人已经分离出很好的优良菌株用于植物生长防病上。现有的发酵生产枯草芽孢杆菌的工序的复杂，生产成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法。本发明在发酵过程中可以根据用量进行连续的发酵培养菌种，不需要每个批次都进行种子的培养，减少生产工序，降低生产成本。

本发明所采用的技术如下：一种枯草芽孢杆菌的连续发酵方法，本方法在无菌条件下进行，方法如下：将枯草芽孢杆菌种子液按照0.5-5％的接种量加入到含有体积百分数70％培养液的发酵罐中，在34-37℃，搅拌转速150-200rpm，通气量0.2-1vvm，pH＝6-9，培养32-40小时；然后将发酵后的培养液在600nm的分光度计下测量值为8-9，镜检视野中90％以上呈现芽孢状时，通过流加和导出装置，每小时导出发酵后的培养液体积比的3-5％，再补充相同量新的培养液，连续操作70-80小时；导出的发酵液即为枯草芽孢杆菌的液体菌悬液；

本发明还具有如下技术特征：

1、所述的培养液按质量百分数配比如下：玉米粉2-3％，酵母粉0.2-0.4％，蛋白胨0.2-0.4％，硫酸铵0.3-0.4％，磷酸二氢钾0.25-0.35％，磷酸氢二钾0.6-0.8％，pH＝7.0-7.5。

2、所述的培养时间优选为发酵36小时后开始进行连续培养。

本发明的有益效果为：发酵过程中仅需要一次种子培养，减少了生产的工序，同等时间产出的发酵液多于单批次发酵，降低了生产成本。本发明所述的发酵形式可用于连续发酵培养和批次发酵培养，适用于带有机械搅拌的液体发酵容器。

具体实施方式

以下实施例都在无菌条件下进行：

实施例1

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，ACCC11088；

菌种活化：将冻干管保存的菌种接种到牛肉膏蛋白胨的液体培养基上，在气浴要床上转速150-200rpm，温度28-32℃下培养20-24小时；取0.1ml溶液按照涂平板的方法均匀平铺到牛肉膏蛋白胨固体培养基中在温度28-32℃下培养20-24小时，作为一代菌种使用；在上述平板中挑取单菌落到LB斜面培养基中在温度28-32℃下培养20-24小时，备用；

种子液的制备：取一接种环在LB培养基上活化好的菌种接种到装液量为100ml种子培养基的500m1三角瓶中，28-32℃，摇床转速150-200rpm下培养16-20小时，所得即为枯草芽孢杆菌液体种子液；

上述的种子液配方为，按质量百分含量：玉米浆2-4％，蛋白胨0.5-1.5％，葡萄糖2-3％，磷酸二氢钾0.5-0.6％，磷酸氢二钾1-2％，pH7.0-7.5；

实施例2

(1)发酵方式：5L发酵罐，连续流加发酵；

(2)发酵过程：将实施例1制得的种子液按照0.5％的接种量，接种到含有体积百分数70％培养液的发酵罐中，发酵控制温度为34℃，pH＝6，搅拌转速为200rpm，通气量为1vvm，培养到40小时，检测指标数据在600nm的分光度计下测量值为8.17，镜检视野中90％以上呈现芽孢状时，通过发酵罐的流加和导出装置，每小时导出发酵后的培养液体积比的3％先导出，后流加补足已灭好菌的新的培养液。此时需要开始需要每小时取样，检测在指标范围内即可导出和流加发酵液，持续70小时；本发明产生的发酵液经过菌和液分离，减压低温烘干菌粉。

所述的培养液按质量百分数配比如下：玉米粉3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.4％，硫酸铵0.3，磷酸二氢钾，0.3％，磷酸氢二钾0.6％，pH＝7.0-7.5；

(3)发酵结果：最终发酵液在600nm的分光度计下测量值为8.17，镜检结果超过90％呈现芽孢状，在制作成菌剂测得菌数102亿CFU/克，最终产生发酵液的数量为13.58升，比较等同时间单批次发酵约为10.5升有很大的提高。证明此方法可进行发酵生产。