[发明专利]一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默病的辅助诊断技术领域，特别涉及一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法，特别指一种能用于检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种系统性神经退行性疾病，其临床表现为高级认知功能低下，主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。阿尔茨海默病患者需要终生护理，因此给社会和家庭带来极大的经济负担。阿尔茨海默病是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找阿尔茨海默病相关基因进而阐明痴呆症发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展阿尔茨海默病的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与阿尔茨海默病的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了阿尔茨海默病预防及治疗水平的提高。

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor)是一种具有神经营养作用的蛋白质，广泛存在于人的神经系统中。脑源性神经营养因子是由位于11号染色体的脑源性神经营养因子基因(brain-derived neurotrophic factor gene，BDNF)(chr11: 27676439..27743604)编码而成的。国内外已有大量研究报道了BDNF 基因单核苷酸多态性与阿尔茨海默病发病的关系，且研究多集中于Val66Met和C270T多态位点。

目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与阿尔茨海默病相关的脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、针对性强、检测准确率高的一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒；通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断阿尔茨海默病，检测方法简单、检测效率高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：

所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：

5’- TTAGTATTTAAGAGGAAAAGGGAAAGTTGT -3’；

所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：

5’- Biotin-CCCCCATCATAACTAAAAATCT -3’；

所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：

5’- GGGAAAGTTGTTGGG -3’。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

一种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤：

步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；

步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq^TM PreMix酶，并加入一对脑源性神经营养因子基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；

步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM甲基化特异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中，在琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温；