[发明专利]一种检测植物蛋白质亚细胞定位的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测植物蛋白质亚细胞定位的方法。

背景技术

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。

蛋白质的亚细胞定位与其功能发挥密切相关。蛋白质是生物功能的直接体现者，有序分布的蛋白质是保证生命个体正常生长、发育的前提，所以了解这些过程的蛋白质亚细胞定位就是为了更好地了解生命过程。植物的生长发育，要适应生长阶段的变化，并且能够抵抗不良环境，这些过程的分子生物学和生物化学的基础就是蛋白质。检测植物蛋白质的亚细胞定位对于了解重要作物的抗逆、高产机理具有重要作用。

来源于水母的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP），其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时（395nm和479nm）可高效发射清晰可见的绿色荧光，是监测活细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想探针。已被广泛地用作报告基因，进行活体的细胞学实验研究。

以往关于植物蛋白质在细胞中的定位研究中，大多数采用的是基因枪转化法。然而，基因枪转化方法对操作者的技术要求较高，并且基因枪操作中的耗材价格非常高，实验准备复杂，成功率并不是特别高。

因此，急需一种可以快速准确检测植物蛋白质亚细胞定位的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测植物蛋白质亚细胞定位的方法。

本发明所提供的检测植物蛋白质亚细胞定位的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将由待测植物蛋白质的编码基因和报告基因融合而成的融合基因克隆到植物表达载体中，得到表达所述融合基因的重组表达载体；

其中，报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。所述报告基因既可以融合于所述待测植物蛋白质的编码基因的5’端，也可以融合于所述待测植物蛋白质的编码基因的3’端。

（2）将所述重组表达载体转化至农杆菌感受态细胞中，得到重组农杆菌；

（3）向所述重组农杆菌中加入农杆菌侵染缓冲液，调节OD₆₀₀为0.1～0.3（如0.3），20-25℃（如25℃）静置1-2h（如1h），得到侵染菌液；

（4）用注射器的针头在植物叶片上避开叶脉扎孔，然后用除去所述针头的所述注射器将所述侵染菌液从扎孔处注射至所述植物叶片内；

（5）培养所述植物30h-48h（如48h）后，从注射部位切取1-2cm²的叶片作为待测材料；根据所述报告基因检测所述待测材料中由所述融合基因编码得到的蛋白质的亚细胞定位，从而确定所述待测植物蛋白质在所述植物中的亚细胞定位。

在所述方法的步骤（4）中，用所述注射器的针头在所述植物叶片上扎孔（如2个距离为3cm的孔），以及用除去所述针头的所述注射器将所述侵染菌液从扎孔处注射至所述植物叶片内，均是从所述植物叶片的背面进行操作的。

在所述方法的步骤（4）中，向所述植物叶片内注射所述侵染菌液时，注射量为每cm²叶片注射0.2mL所述侵染菌液。

在所述方法的步骤（1）中，所述报告基因为荧光蛋白的编码基因；所述荧光蛋白具体为增强型绿色荧光蛋白（简称为EGFP，氨基酸序列为序列表中序列1）。相应的，步骤（5）中，根据所述报告基因检测所述待测材料中由所述融合基因编码得到的蛋白质的亚细胞定位，为：将所述待测材料压片后采用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜通过成像分析对由所述融合基因编码得到的蛋白质进行亚细胞定位。其中，将所述待测材料（从注射部位切取1-2cm²的叶片）进行压片为：将叶片背面朝上置于载玻片上，并在所述载玻片上滴2-3滴蒸馏水，使叶片完全浸湿，盖上盖玻片。另外，采用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行成像分析时，需要根据所述荧光蛋白的激发波长设置相应的显微镜使用参数。

在所述方法的步骤（1）中，所述植物表达载体可为任何用于植物表达的载体，如pBI121等。在本发明中，所述植物表达载体中启动所述融合基因转录的启动子为CaMV35S启动子；终止所述融合基因转录的终止子为NOS终止子。更加具体的，所述植物表达载体为pCAMBIA2300载体。

相应的，在所述方法的步骤（1）中，最终构建得到的所述重组表达载体为如下中任一：