[发明专利]一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，涉及一种用于检测作用于Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用，具体涉及一种用于检测作用于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry1A类原毒素的胰蛋白酶活力的荧光底物及其应用。

技术背景

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种革兰氏阳性、杆状、可形成芽孢的土壤细菌。在其生长过程中伴随着芽孢的形成，细胞能合成蛋白晶体，由于这些晶体蛋白对昆虫具有毒杀作用，因而又被称为杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs），其中δ-内毒素是最重要的一类杀虫蛋白。δ-内毒素按照结构特点及作用机制的不同又分为Cry毒素和Cyt毒素。和Whiteley在1989年主要根据杀虫谱的不同，将Cry毒素分为CryI、CryII、CryIII、CryIV和CryV-IX几大类，这些不同类型毒素除了杀虫谱不同外，在氨基酸的同源性、分子量大小等方面也有差异。随着Bt新基因不断发现，许多新基因序列同源但杀虫谱不同，或杀虫谱相同但序列不同源，采用原有的命名系统容易出现混乱。因此，Crickmore等修订了编码Bt毒素的Cry基因命名和分类系统，统一以氨基酸序列一致性和进化关系为基础，进行4级命名。Cry1表示1家族（氨基酸一致性超过45%），Cry1A表示1A亚家族（氨基酸一致性超过78%），Cry1Aa表示1Aa基因（氨基酸一致性超过95%），Cry1Aa1表示1Aa基因的第1个等位基因（Crickmore et al.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.Mocrobiology and Molecular Biology Reviews,1998,62(3):807-813）。

Cry毒素蛋白对昆虫的毒杀作用大致有以下四个步骤：（1）在昆虫中肠的碱性环境下，晶体蛋白被溶解，释放原毒素；（2）中肠蛋白酶对原毒素进行加工形成活化毒素；（3）活化毒素与中肠细胞的刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的受体结合；（4）在中肠细胞膜上形成孔洞，使细胞裂解，渗透压失衡，导致昆虫死亡。Cry1A类原毒素是一类分子量在130-140KD的伴胞晶体蛋白，由三个结构域组成。结构域Ⅰ由N端的疏水α-螺旋组成，位于中间的一个疏水的α-螺旋被其他6个两亲α-螺旋环绕，孔洞形成与该结构域相关；结构域Ⅱ由β折叠组成，三个平行的β折叠形成不对称的β棱柱，其中的一个β折叠反向包裹结构域Ⅰ，毒素与受体结合及抗虫特异性和该结构域相关；结构域Ⅲ由位于C端的两个反向平行的β折叠组成，高度可变的结构域Ⅲ与昆虫中肠上的受体结合、杀虫特异性及结构稳定相关。但这种结构的原素素必须经过昆虫中肠蛋白酶消化为65kDa左右比较稳定的活性多肽后才发挥后续的毒杀作用，活化过程包括几乎整个C端的剪切和在N端25-30个氨基酸被切除，Cry1Ac原毒素的消化已证实发生在N端28位精氨酸处，现有研究表明胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶主要参与了这个过程（Johnston et al.Resistance to Bacillus thuringiensis by the Indian meal moth,Plodia interpunctella:comparison of midgut proteinases from susceptible and resistant larvae.Journal of Invertebrate Pathology,1990,55(2):235-244）。

因此，昆虫中肠蛋白酶酶解活化是一个毒素发挥毒杀作用和害虫对毒素产生抗性的关键步骤，如果其发生变化会导致对原毒素的活化能力降低和对毒素降解作用增强。Oppert等（1997）研究了以Bte HD-198筛选的抗性印度谷螟中肠蛋白酶活性后发现，抗性的产生是由于其活性降低而对原毒素的活化作用下降，进一步研究表明在抗性品系中缺失了一种重要的中肠蛋白酶。Forcada等（1996）在抗性烟芽夜蛾CP73-3上也发现由于中肠蛋白酶对Cry1Ab原毒素活化作用的下降及对Cry1Ab降解作用的上升。在抗性小菜蛾和欧洲玉米螟中，蛋白酶活化作用降低也是一个重要的抗性机理。