[发明专利]一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测四种常见白血病融合基因的多重PCR试剂盒。

背景技术

多重PCR工作原理是在同一PCR反应体系里加入多对引物，同时扩增多个DNA片段的PCR反应，作为PCR重要衍生技术之一，该方法具有高效性、经济简便性，可大大节约时间和试剂成本等诸多优势。目前该技术已广泛应用于生物技术、检疫和医学检测等领域。

多重PCR反应中，一般包括以下试剂：两对以上引物对、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、模板DNA、Taq DNA 聚合酶以及其他佐剂(DMSO、甘油、BSA)，通常为了获得比较好的扩增结果，会对试剂的使用量、PCR扩增的反应条件，例如延伸温度、延伸时间、退火时间、退火温度、PCR循环数等，进行优化。

白血病患者的遗传学特征异常复杂多变，包括染色体的易位、缺失、突变和倒位等，这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为诊断不同类型白血病的分子标志，此外，不同类型的白血病化疗和放疗的治疗方案亦不同。因此，融合基因的检测对白血病的诊断、预后、监测微小残留病和指导用药等具有重要的指导价值，已成为白血病诊断标准最重要的指标之一。

BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO、E2A/PBX1是四种最常见的白血病融合基因。其中，约95%的慢性粒细胞白血病患者能检测到BCR/ABL融合基因；85%以上的急性早幼粒细胞白血病涉及PML/RARα融合基因；而AML1/ETO融合基因是最常见的核型异常之一，在M2亚型急性髓系白血病中约占30%-50%；E2A/PBX1融合基因见于约3-5%的儿童和3%的成人B细胞型急性淋巴白血病，是儿童急性淋巴细胞白血病诊断和治疗中的重要检测指标。基于以上原因，选取了这四种发病率高的白血病融合基因作为本研究的检测靶标。

作为PCR重要衍生技术之一，多重PCR有着诸多优势：(1)高效性，减少操作流程，可同时检测多个基因或片段；(2)经济简便性，可大大节约时间和试剂成本。其可在一次实验中同时检测多种常见白血病融合基因，有力地弥补了染色体核型分析的不足，提高了隐匿性易位染色体的检出率。目前，临床常用白血病分子诊断方法主要以Poul Jorgensen为代表的逆转录多重PCR检测方法，此类方法一般将反应体系分成八管，每管检测不同类型的融合基因且产物片段大小存在明显差异，依据扩增产物所在反应管位置及片段大小判断融合基因类型。由于在同一反应体系中多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构、二聚体结构等，从而影响扩增效率，这是分为八管进行检测的主要原因，但这亦同时导致了该类检测方法复杂、繁琐，对操作人员相关专业要求较高，难以推广。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种常见四种白血病融合基因的逆转录多重PCR检测试剂盒，利用其可检测出BCR-ABL、PML/RARα、AML1/ETO、E2A/PBX1这四种常见白血病融合基因的7个剪切异构体，具体包括：BCR/ABL e1a2、BCR/ABL e13a2、BCR/ABL e14a2、PML/RARα L型、PML/RARα S型、E2A/PBX1Ⅰ型和AML1/ETO。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种检测白血病融合基因的多重PCR试剂盒，所述多重PCR试剂盒包括：常规多重PCR组件，还包括针对常见白血病融合基因的嵌合引物以及公共引物对，所述公共引物对包括以下核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：公共引物对中的正义引物5’- AGACATCGTAGGTAGTGACA -3’；SEQ ID NO.2：公共引物对中的反义引物 5’- GAACGGACGACAATACAGTG -3’；

所述针对常见白血病融合基因的嵌合引物为针对常见白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARα、AML1/ETO、E2A/PBX1的多条嵌合引物对，具体如以下核苷酸序列所示：

 上述技术方案中，所述常规多重PCR组件包括：阳性对照引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水。

阳性对照可用来检测cDNA模板质量和反应体系扩增效率，本发明优选基于GAPDH基因的阳性对照引物，具体序列为：SEQ ID NO.15，AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；SEQ ID NO.16，GTGATGGCATGGACTGTGGT。

上述技术方案中，在进行PCR反应时每条针对常见白血病融合基因的嵌合引物的浓度为1 μM。