[发明专利]基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法

权利要求书

1.一种基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于包含以下步骤：（1）分别制备绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物；（2）将绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物混合，并与梯度浓度的OTA标准品溶液在结合缓冲液中共孵育，在波长450 nm的激发光下测定绿色量子点能量转移效率；以OTA标准品溶液浓度对数值为横坐标，绿色量子点能量转移效率为纵坐标，绘制检测OTA的标准曲线；（3）将待测样品提取液、绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物在结合缓冲液中共孵育，测定绿色量子点能量转移效率，与标准曲线比对即得到待测样品提取液中OTA含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述绿色量子点和红色量子点满足：绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm，表面氨基化修饰的量子点；红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm，表面羧基化修饰的量子点。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中绿色量子点与OTA偶联，采用NHS活化法制备OTA与绿色量子点偶联物，葡萄糖酸封闭绿色量子点表面残留的氨基位点；量子点与OTA偶联摩尔比为1：2～1：20，优选为1：10。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中红色量子点与抗OTA单域抗体偶联，抗OTA单域抗体通过免疫羊驼后分离血清获得，采用EDC，NHSS介导将红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联，氨基葡萄糖封闭红色量子点表面残留的羧基位点，量子点与抗OTA的单域抗体偶联摩尔比为1：1。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA单域抗体偶联物混合摩尔比为1：1～1：6，优选为1：5。

6.如权利要求3或4所述方法，使用的EDC和NHSS的物质量分别是量子点的100～500倍和50～100倍；活化时间是20～40min；偶联时将pH值调至7～8，偶联时间是20～40min；封闭剂葡萄糖酸或氨基葡萄糖的终浓度是0.1%～2%，封闭时间是0.5～1小时；封闭后调pH值至弱酸性为pH 4.5至5.5；偶联产物用高速离心方法分离出来，离心条件是4℃～10℃，12000r/min～20000r/min ，20～40min；复溶液为含有20%至30%丙三醇的0至0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）结合缓冲液为含10%甲醇的0.01 M 磷酸盐缓冲液，溶液pH值为7.4，结合温度为37℃，结合时间20 分钟。

8.如权利要求1所述方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）试剂1即绿色量子点与OTA偶联物的制备：

1）OTA的活化：每1mg OTA溶解于0.1mg无水四氢呋喃，加入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及2mg N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）于室温下避光剧烈摇动1小时，活化后4000r/min离心15min；取上清，挥发四氢呋喃，残留物溶解于0.2mL二甲基甲酰胺； 2）偶联：每在洁净的小烧杯中加入0.2mL 硼酸盐缓冲液和5μL浓度为10μM的绿色量子点，缓慢加入浓度为10μM的OTA活化物50μL，使OTA与绿色量子点偶联摩尔比为10，室温、避光下偶联1.5h； 3）封闭：加入质量浓度1%的葡萄糖酸100μL封闭45min，缓调pH至5.0； 4）纯化：4℃，19000r/min，离心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20μL复溶，得到的复溶液为后续实验的1000×试剂1母液；

（2）试剂2即红色量子点与OTA单域抗体偶联物的制备：

1）红色量子点活化：每在洁净小烧杯中加入0.2mL 硼酸水溶液，缓慢加入5μL浓度为10μM的红色量子点，将8μL 0.5mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和2μL 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS）混匀后加入，室温活化20min； 2）偶联：逐滴加入浓度为10μM的OTA单域抗体5μL，使OTA单域抗体与红色量子点偶联摩尔比为1：1，用0.1M NaOH调pH至7.4，室温偶联30min； 3）封闭：加入5%氨基葡萄糖100μL封闭45min，用0.1M 盐酸缓调pH至5.0； 4）纯化：4℃，19000r/min，离心30min，吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸缓冲液（0.01mol PB，pH7.4）20μL复溶，得到的复溶液为后续实验的200×试剂2母液；

（3）OTA浓度标准曲线的制作：每各取试剂1和试剂2母液1μL，分别用1mL和0.2mL超纯水稀释，得到试剂1和试剂2待用液；10μL试剂1与90μL试剂3（含10%甲醇的1×PBS，pH7.4）混合，在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度，得到数据记为F；将10μL试剂1、10μL试剂2和用80μL试剂3倍比稀释的OTA溶液（0 ng/mL至5 ng/mL），37℃孵育20min后，在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度，得到数据记录为F_N，分别代表F₀，F_0.01、F_0.06、F_0.08、F_0.1、F_0.3、F_0.5、F₁和F₅，其中下标数值代表OTA溶液浓度（ng/mL）；将（F－F_N）/ F×100%记录为荧光能量转移效率E（%）；以OTA浓度对数值为横坐标，荧光能量转移效率E（%）为纵坐标，绘制出的检测OTA浓度的标准曲线；

（4）OTA的检测：

1）待测样品溶液准备：每取待测样品1g，用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取5min，5000 g离心10min，上清液经0.45μm滤器过滤，取100μL体积加入100μL 0.01M，pH7.4的2×PBS和400μL的pH7.4的1×PBS稀释，即得30倍稀释的待测样液；

2）取80μL待测样液与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min，在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度，计算待测物的E（%）值，代入OTA浓度的标准曲线即得到待测样液中OTA含量。