[发明专利]子宫内注射外源基因法生产转基因哺乳动物的技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备转基因哺乳动物的方法。 

背景技术

哺乳动物转基因技术是由基因工程和胚胎工程相结合的一门新型生物技术。它是将人工重组的外源DNA通过人为的方法导入受体动物的基因组，或者切除受体基因组中的一段DNA，从而使受体动物的遗传信息（基因型和表现型）发生人为性的改变，并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术^[1]。 

自1974年的嵌合体小鼠^[2]诞生以来，哺乳动物转基因技术给发育生物学、医学和畜牧业等学科领域带来了一场新的技术革命。随着分子生物学和生物技术的发展，哺乳动物转基因技术取得了长足的发展。借助转基因动物模型 ^[3,4,5]，将分子、细胞、组织、器官、及个体的发生发育和衰老统一起来，从时间和空间综合角度研究基因的表达调控规律；通过转基因动物模型，可研究遗传病的发生、发展规律，随着基因定点整合^[6,7]技术的成熟，转基因技术可能成为治愈人类遗传疾病的一种重要手段；通过转基因技术培育抗病力强、生长速度快、畜产品产量和质量高的转基因动物，以及通过转基因动物生产药用或营养蛋白^[8,9]、为人类提供异源器官等，最终提高畜牧业的经济效益。 

    自20世纪80年代的嵌合体鼠诞生以来，各国学者不断寻求以操作简单、成本低、高效转基因的为目的转基因技术。但是，到目前对哺乳动物进行转基因生产常用的转基因手段为：显微注射法、精原干细胞转染、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞法、原始生殖细胞(PGC)和精子等技术方法。 

1. 显微注射(microinjection)法 

显微注射(microinjection)，利用显微操作技术，直接将精子注射到成熟卵母细胞胞质的方法，称为胞浆内精子注射技术。在显微操作环境中，采用该技术方法，将体外构建好的目的基因片段注射到原核时期的受精卵的原核当中，随着受体受精卵DNA合成或修复，外源基因整合到其基因组中。显微注射法是目前公认的转基因效果最好，制作转基因动物应用最广的操作方法^[10,11]。

显微注射法的优点是可以把100kb以下的不同长度且不含原核载体的DNA片段注入原核当中，并能得到外源基因有效表达的阳性转基因动物。但是，该技术也存在着许多制约因素，基因组DNA只能增加不能敲除或在指定的位点修饰，而且外源DNA的整合位点和拷贝数也无法控制；显微注射法成本之昂贵，胚胎成活率之低，尤其是大家畜上，制备一个转基因动物时需要大量的胚胎为基础，再加上设备昂贵、操作复杂，以及对技术人员操作技术要求高等因素限制该技术应用。 

2逆转录病毒感染法 

1976年，虽然Jaenich等是首次利用逆转录病毒感染法获得了阳性小鼠，但是外源基因却表现为沉默。直到1998年，Chan A.W.等^[12] 利用慢病毒成功转染牛的卵母细胞和Cabot（2001）等^[13] 成功转染体外成熟的猪卵母细胞,并获得转基因猪，逆转录病毒感染法才重新被人们广泛重视。

逆转录病毒是双链RNA病毒，侵染细胞后在自身的反转录酶的作用下，以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。其具体方法是将载体病毒放入动物早期胚胎的培养液中 ^[14]、将载体病毒注入囊胚腔 ^[15,16]、体外培养转染精子或卵母细胞^[17,18]。用逆转录病毒载体法生产转基因动物具有操作简单、不受胚胎发育阶段的影响，并且基因表达效率高；单位点、单拷贝整合，易鉴别分析插入位点等优点。但是，用此法感染胚胎细胞时，如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物；但是，如果发生在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，嵌合体的下一代可能有纯系转基因动物，这样的话实验周期就很长。并且所携带的外援基因片段长度受到很大的限制，一般不能超过10kb^[19]。 

随着对逆转录病毒感染法的深入研究，人们发现基因沉默现象，其主要作用机制为：反式作用因子可通过与病毒启动子内特异序列结合而影响DNA前病毒的表达；整合的前病毒及两侧宿主DNA序列的甲基化，抑制其表达^[20]。 

再加上载体病毒基因有潜在致瘤和引起病毒血症的危险，这就限制了使用逆转录病毒真被转基因动物的广泛应用。