[发明专利]一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对；

其中，假单胞菌RNA聚合酶亚单位gyrB的上下游引物为：

P1:5’CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3’；

P2:5’CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3’；

香鱼假单胞菌gyrB的上下游引物为：

P3:5’CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3’；

P4:5’GGTCATCTCACGAGCTTTCG3’；

致病性香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统调节因子exsA的上下游引物为：

P5:5’TTGCTCAGCGAGATCAAAC3’；

P6:5’GCTCATCTATCCAAACCCTC3’。

2.如权利要求1所述的一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒具体由下列试剂组成：

TaqDNA聚合酶0.05mL、10×PCR缓冲液0.5mL、脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL以及浓度分别为10μM的假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对200μL。

3.一种应用如权利要求2所述的试剂盒快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1）假单胞菌的初步分离：从假单胞菌的培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板；

2）多重PCR扩增包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述DNA模板溶液38-60ng/μL，用上述试剂盒进行检测，反应体系为20-30.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶0.02U/μL，PCR缓冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物1.0mmol/L，引物P1、P2各0.2-0.24μmol/L，P3、P4各0.4-0.6μmol/L，P5、P6各0.32-0.48μmol/L，余量用重蒸水补足；b、扩增反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，60.4℃退火45s，72℃延伸40s，循环30次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。

4.如权利要求3所述的快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤a的多重PCR扩增的反应体系具体为25.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶0.25μL，10×PCR缓冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物1.0μL，引物P1、P2各0.5μL，P3、P4各1.0μL，P5、P6各1.0μL，重蒸水补足至总体积25.0μL。