[发明专利]一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法

权利要求书

1.一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法，其特征在于：将电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟，胰蛋白酶剪切多肽1上的精氨酸羧基位点，糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点，使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面，导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降，随着胰蛋白酶和糜蛋白酶浓度的增大，硫堇和二茂铁的峰电流逐渐减小，峰电流减小的程度分别与胰蛋白酶和糜蛋白酶在0.006-0.18 μg/mL和0.0055-0.25 μg/mL范围内呈良好的线性关系，检测限分别为2.5 ng/mL和1.6 ng/mL，表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法，其特征在于：所述的电化学传感器，构建方法为：将金电极浸入DNA1-多肽1和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时，用1 mM的巯基己醇封闭1小时，再浸入含有DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁纳米信号探针的溶液中，通过DNA杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。

3.根据权利要求2所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法，其特征在于：DNA-AuNPs-电子介体纳米信号探针的制备方法包括以下步骤：

（1）金纳米粒子的制备：50 mL的0.01% HAuCl₄溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾，然后加入1 mL质量浓度为5%的柠檬酸三钠，继续搅拌并保持沸腾状态，直至溶液颜色由黄色变成深红色，继续保持沸腾10分钟，自然冷却至室温，将制备的金纳米粒子放在4°C冰箱中保存；

（2）DNA-多肽复合物的制备：将200 μL 25 μM多肽、200 μL 5 μM的DNA和1mg/mL链霉亲和素混合均匀，室温下反应3小时，未反应的DNA和多肽经6000转/分钟的转速超滤5分钟除去，得到DNA-多肽复合物，于4 °C保存；

（3）电化学纳米信号探针的制备：将0.3 mL 25 μM的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混合反应24小时，制备的DNA-AuNPs复合物用1 M的NaCl稳定；将0.2 mL 0.1 mM的电子介体加入0.2 mL的DNA-AuNPs溶液中，在25 oC持续搅拌反应24小时，加入1 mL质量浓度1%的BSA，反应1小时，所得溶液在16000转/分钟的转速下离心10分钟，去除上层清液，将产物重悬于浓度为10 mM、pH 为7.7的磷酸盐缓冲溶液中，制成DNA1′-AuNPs-硫堇和DNA2′-AuNPs-二茂铁纳米信号探针。