[发明专利]利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，属于土壤微生物生态学领域。

背景技术

全球稻田面积约1.5亿公顷，75%处于淹水状态。厌氧环境使得水稻土含有丰富的小分子有机酸。通过代谢这些物质，微生物驱动着稻田生态系统的生物地球化学循环过程。甲酸是稻田有机质降解过程中重要中间产物之一，在水稻土中的浓度可以高达150 μM。水稻土中多种微生物可以代谢甲酸，如Clostridia纲内多种厌氧细菌可利用甲酸为电子供体执行硫酸盐还原和铁还原过程。同时，甲酸也是稻田甲烷排放的重要前体：每年稻田甲烷排放量占每年全球甲烷排放量的4-9%，约25-54 Tg，其中甲酸和H₂/CO₂产生的甲烷量合占稻田甲烷排放量的10-30%。鉴于甲酸是稻田甲烷排放的重要前提，以及甲酸在水稻土中的高含量，我们推测水稻土中一定存在能够直接代谢甲酸的产甲烷古菌。然而，水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌却尚未见报道。其原因第一，目前可培养的微生物只占全部微生物的1%，大量微生物只能在特定的生境中存活和执行生态功能，还无法纯培养；第二、产甲烷古菌是严格厌氧微生物，其对生长环境的要求很高，传统方法很难筛选到；第三、虽然在纯培养条件下部分产甲烷古菌能够利用甲酸生长，但是纯培养条件不能代表水稻土中的原位生境，所以获得的菌株不能反映水稻土中的真实情况。近年发展起来的DNA稳定性同位素探针技术（DNA-based Stable Isotope Probing）为我们的原位鉴定提供了可能。

DNA稳定性同位素探针技术结合实时定量PCR和指纹图谱等分子生物学方法，能够定向发掘复杂土壤环境中参与特定生态过程的微生物资源，是当前土壤功能微生物原位鉴定较为有效的手段之一。DNA稳定性同位素探针技术基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，当特定土壤微生物利用该标记底物生长繁殖，就会同化代谢底物上含标记的元素，并用于合成其生物质，如DNA等。因此，通过对环境DNA进行提取分离鉴定和比对分析，即可鉴别出土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法能够准确揭示执行特定功能的微生物，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段之一。鉴于稻田甲酸和产甲烷古菌在生物地球化学循环过程中的重要性，该技术在水稻土中甲酸利用型产甲烷古菌鉴定上的应用，将有助于扩大我们对微生物所驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能的认知。

发明内容

解决的技术问题：本发明所要解决的技术问题在于提供一种DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，以填补相关的理论空白，对于了解微生物驱动的稻田养分循环过程和稻田产甲烷古菌功能群的生态功能认知都有重大的贡献。

技术方案：本发明所述的一种利用DNA稳定性同位素探针（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，其工艺流程如图1所示，具体包括以下步骤：

（1）采集水稻土样品；

（2）进行¹³C-甲酸的微宇宙培育实验；

（3）利用超高速离心机对¹³C-甲酸培育的土壤微生物总DNA进行离心分层；

（4）对分层后多个浮力密度中的产甲烷古菌基因进行实时定量PCR分析和指纹图谱分析，最终确定该水稻土中具有代谢活性的甲酸利用型产甲烷古菌。

所述的微宇宙培育实验的步骤为：将100 mg ¹³C-甲酸加入到装有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用无菌去离子水调至田间土壤最大持水重量的60%，并用氮气置换玻璃瓶中空气后用橡胶塞密封，以保持培养体系的厌氧环境；同时以¹²C-甲酸和不加甲酸的处理为分别为对照，放置28℃培养箱恒温培养，每隔3天抽出1.2 mL上层空气，利用气相色谱仪测定甲烷气体浓度变化，待甲烷浓度开始降低停止培育实验。